PDF Download - Laborwelt

Weitere Magazine

Empfehlungen

Info

Blitzlicht Microarrays Tab. 1: Quantitative Proteinmicroarray-Anwendungen Multiplexing-Kapazität RPPA MIA Anzahl Zielproteine 50-200 5-10 Probenkapazität 2000-4000 10-20 Signalbereich 10 3 -10 4 Größenordnungen Empfindlichkeit pERK [ng/mg lysate] 1000 750 500 250 0 0 10 20 30 40 50 60 Träger gedruckt. Die Quantifizierung wird dann vergleichbar zu den klassischen ELISA- Techniken mit Hilfe eines zweiten Antikörpers durchgeführt, der ein weiteres Epitop des Zielproteins erkennt (Abb. 4). Im Microspot- Immunoassay (MIA) wird die ELISA-Strategie miniaturisiert und im Multiplex-Format für die gleichzeitige Quantifizierung mehrerer Phosphoproteine eingesetzt. Dank des miniaturisierten Maßstabs ändert sich die Konzentration des Analyten während der Messung nicht, und es werden exaktere Werte erhalten als mit Standard-ELISA-Techniken möglich ist 12 . Im miniaturisierten Maßstab werden die Fängerantikörper als winzig kleine Replikat- Spots auf Nitrozellulose-beschichtete Träger gedruckt. Da der Array aus Fängerantikörpern mehrfach – im gezeigten Beispiel 16-fach – auf den Slide gedruckt wird, entstehen nach einer Kompartimentierung der Oberfläche 16 kleine Inkubationskammern von denen ein Teil für die Aufnahme einer multiplexen Verdünnungsreihe genutzt wird. Die übrigen Inkubationskammern stehen für Vermessung der biologischen Proben zur Verfügung. Die Detektion der spezifisch gebundenen Proteine erfolgt mit einem Cocktail aus Detektionsantikörpern und in einem zweiten Schritt die Visualisierung der Antikörper- Picomolar Femtogramm Protein/Spot time [min] Femtomolar Picogramm Protein/ml Readout Qualitative Änderungen Exakte Quantifizierung HGF 5ng/ml HGF 20ng/ml HGF 40ng/ml negative control Abb. 5: Dosisabhängige Aktivierung der Signaltransduktion durch den Hepatischen Wachtumsfaktor (HGF) in der Brustkrebszellinie HCC-1954. HGF bindet an seinen Rezeptor MET, der für die Weitergabe des Signals dimerisieren muss. In der Zelllinie HCC-1954 wird in erster Linie die Phosphorylierung von ERK1/2 aktiviert. Protein-Komplexe mit fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern. Eine maßgeschneiderte Software berechnet die Konzentration eines jeden Analyten in der Probe 13 . Im Hinblick auf die Sensitivität können ohne weiteres femtomolare Mengen eines Analyten detektiert werden. Im Gegensatz zu den RPPA liefert dieser Ansatz sehr präzise quantitative Daten und ermöglicht auch Untersuchungen zur dosisabhängigen Aktivierung von Signalwegen (Abb. 5). Produktion von Protein-Microarrays Da Protein-Microarrays quantitative Aussagen der untersuchten biologischen Proben liefern sollen, ist die Reproduzierbarkeit und Standardisierung der experimentellen Parameter ein wichtiger Aspekt: So ist bei der Produktion der Arrays eine über viele Proben hinweg einheitliche Tropfengröße unverzichtbar. Geringe Unterschiede in der Tropfengröße (wenige Prozent) können durch geeignete Normalisierungsverfahren ausgeglichen werden. Die Abgabe der Proben auf den Festphasenträger kann dabei mit Hilfe eines direkten Kontakts zwischen Druckernadel und Slide realisiert werden. Andere Dru- cker geben in einem kontaktlosen Verfahren winzige Tropfenmengen ab. Im Hinblick auf die Zeit unterscheiden sich unterschiedliche Druckverfahren beträchtlich. Schnelle Drucker benötigen für die Probenabgabe auf eine vorgegebene Anzahl Slides nur eine halbe Stunde. Langsame Drucker brauchen für denselben Druckvorgang 15 bis 18 Stunden. Die Geschwindigkeit des Druckvorgangs ist bei der Produktion von Antikörperarrays von untergeordneter Bedeutung. Im Falle von RPPA ist die Zeit jedoch ein wichtiger Faktor, da in komplexen biologischen Proben biochemische Prozesse weiterlaufen, die möglicherweise auch zur Degradation des Zielproteins beitragen, und es sind daher schnelle Druckverfahren von Vorteil. Zusammenfassung Grundsätzlich besitzen Protein-Microarrays gegenüber Gel-basierten Techniken eine ausgesprochen hohe Probenkapazität, eine exzellente Sensitivität und einen großen dynamischen Bereich. Sowohl RPPA wie auch MIA sind mit der Untersuchung von klinischen Proben kompatibel. Dank ihrer hohen Sensitivität und Flexibilität sind Protein-Microarray-basierte Methoden eine exzellente Ausgangsbasis, um die Dynamik und Komplexität von biologischen Prozessen gezielt zu untersuchen. Protein- Microarrays sind darüber hinaus auch für die Wirkstoffforschung und die Entwicklung der individuellen Tumortherapie eine vielversprechende Plattform (Tabelle 1). Literatur [1] Bell, D.W. et al., J. Clin. Oncology, 23 (2005), 8081-8092. [2] Yarden, Y., Oncology, 61 (2001), 1-13. [3] Mendelsohn, J., Baselga, J., Oncogene, 19 (2000), 6550-6565. [4] Neeley, E.S. et al., Bioinformatics, 25 (2009), 1384-1389. [5] Zhang, L. et al., Bioinformatics, 25 (2009), 650-654. [6] Gulman, C. Et al., K.M., J Pathol., 218 (2009), 514-519. [7] Vasudevan, K. et al., Cancer Cell., 16 (2009), 21-32. [8] Paweletz, C.P. et al., Oncogene. 20 (2001), 1981-1989. [9] Sahin, O. et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 104 (2007), 6579-6584. [10] Sahin, O. et al., BMC Syst Biol., 1 (2009), 1. [11] Löbke, C. et al., Proteomics, 8 (2008), 1586-1589. [12] Poetz, O. et al., Proteomics, 9 (2005), 2402-11. [13] Korf, U. et al., Proteomics, 8 (2008), 4603-4612. Korrespondenzadresse Dr. Ulrike Korf Quantitative Proteomics Deutsches Krebsforschungszentrum Im Neuenheimer Feld 580 69120 Heidelberg Tel.: + 49-(0)6221-424765 Fax: + 49-(0)6221-423454 u.korf@dkfz.de www.laborwelt.de 32 | 10. Jahrgang | Nr. 5/2009 LABORWElT
Weltkongress für Regenerative Medizin: Forschungselite in Leipzig Thomas Gabrielczyk, Redaktion LABORWELT Aktuelle Forschung und mögliche Anwendungen von Stammzellen und des Tissue Engineerings, aber auch Technologien zur reproduzierbaren Kultivierung von Zellen und Geweben für den medizinischen Einsatz sowie Methoden, diese möglichst immunkompatibel zu implantieren, stehen im Mittelpunkt, wenn sich vom 29. bis 31. Oktober die Weltelite der Stammzellforscher auf der Weltkonferenz für Regenerative Medizin in Leipzig trifft (www. wcrm-leipzig.com/). Organisiert vom TRM Leipzig – dem deutschen Translationszentrum für die Regenerative Medizin – bietet der internationale Meeting eine Auswahl an Vorträgen, die jedem Vergleich standhält. Dass das Forschungsfeld hochdynamisch ist und methodisch signifikant vorangekommen ist, dokumentierte Ende September nicht zuletzt die Verleihung der als „US-Nobelpreise“ gehandelten Lasker-Awards an zwei Stammzellforscher – den Entdecker der induzierten pluripotenten Stammzellen, Shinya Yamanaka (Univ. Kyoto), und John Gurdon (Univ. Cambridge,UK), einem Pionier der Zellkerntransfer-Technologie. Abb.: Komplexe Ko-Kultivierung von Nerven- und Muskelzellen auf einem Bio-Nanofaser- Scaffold aus Polymilchsäure Gemäß der Interdisziplinarität des Forschungs- und Anwendungsfeldes Regenerative Medizin ist die thematische Spannweite der Vorträge in den fünf Themenschwerpunkten „Stem Cells“, „Tissue Engineering“, „Technology Development“, „Immunology and Signaling“ sowie „Regulatory Affairs“ sehr weit. So wird etwa John Hunt vom UK Centre for Tissue Engineering an der Universität Liverpool berichten, wie die Dip Pen-Nanolithographie (DPN®) eingesetzt werden kann, um den Phänotyp von Stammzellpopulationen durch definierte Zugabe benötigter Faktoren zu definieren und damit das Problem heterogener Zellpopulationen zu lösen, das einer medizinischen Anwendung von Stammzellen als Ersatzzellen oder in zellbasierten Assays derzeit noch entgegensteht. Jeffrey Karp vom US-Eliteinstitut MIT (Cambridge, USA) dagegen stellt biomimetische Adhäsive für den biomedizinischen Einsatz vor, die den adhäsiven Regionen des Geckofusses nachgebildet sind. Die vom britischen Start-up-Unternehmen Regentec Ltd. in Leipzig präsentierte Injectible scaffold-Technologie zielt darauf ab, im Körper eine definierte Mikroumgebung für Zellen zu schaffen, die zur Knochenreparatur eingesetzt werden. Die Entwicklung geeigneter resorbierbarer Gerüstmaterialien ist ein ständiges Arbeitsfeld des Tissue Engineering, aber auch der Stammzellforschung (vgl Abb.), über dessen Neuerungen die Forscher auf dem WCRM in Leipzig diskutieren werden. Blitzlicht Kongress Cell Culture goes fully automated Biomek ® Cell Workstation Besuchen Sie uns! Halle 9, Stand E26 Process to Solution Maintenance - Expansion - Production ¸ total process control ¸ integrated data handling and decision making ¸ flexible process definition editor ¸ cell viability check with integrated Vi-CELL ® ¸ small footprint Expansion Options through modular design to get i.e. cell line optimisation or monoclonal antibody production workstations Beckman Coulter GmbH 47807 Krefeld Europark Fichtenhain B13 Tel. 02151/333 625 www.beckmancoulter.com Genomics Proteomics Cell Analysis Centrifugation Lab Tools Particle Characterization Bioseperation Lab Automation LABORWElT 10. Jahrgang | Nr. 5/2009 | 33
Seite 1 und 2: laborwelt Nr. 5 / 2009 - 10. Jahrga
Seite 3 und 4: Krebs: Vielfalt der Signale... Stat
Seite 5 und 6: © 2009 Thermo Fisher Scientific In
Seite 7 und 8: Für höchste Effizienz muss man ni
Seite 9 und 10: novo-AML-Patienten zu screenen. Ein
Seite 11 und 12: P.O.S. KRESIN DESIGN GmbH · P0908-
Seite 13 und 14: den meisten Fällen von Brustkrebs
Seite 15 und 16: Report Metastasierung Brustkrebs un
Seite 17 und 18: in normalen Brustepithelien spielen
Seite 19 und 20: www.laborwelt.de die Flt3-Liganden-
Seite 21 und 22: Blitzlicht DNA-Methylierung BEAMing
Seite 23 und 24: Abb.2: Anwendungsgebiete der BEAMin
Seite 25 und 26: © 2009 PerkinElmer, Inc. 400169_01
Seite 27 und 28: Protein-Microarrays: Sensitive quan
Seite 29: CO 2 - Abfall oder Rohstoff? Mögli
Seite 33 und 34: Abb.1: An Subfields normalisierter
Seite 35 und 36: tebu-bio GmbH Berliner Str. 255, 63
Seite 37 und 38: ‡ Verbinden Sie bis zu 30 Cycler
Seite 39 und 40: Microsynth AG Schützenstr. 15 CH-9
Seite 41 und 42: Roche Diagnostics GmbH Sandhofer St
Seite 43 und 44: Max-Planck-Institut für Neurobiolo
Seite 45 und 46: Paul-Ehrlich-Institut Paul-Ehrlich-
Seite 47 und 48: Fujifilm DNA-Extraktion für die IV
Seite 49 und 50: September 2009-November 2009 Verans
Seite 51 und 52: Join the pre-conference partnering

PDF Download - Laborwelt

Erfolgreiche ePaper selbst erstellen

Template löschen?

Als Template speichern?