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Blitzlicht DNA-Methylierung
BEAMing: Sensitive
Plasmadiagnostik in
der Onkologie
Wiebke Peters, Dr. Philipp Angenendt und Dr. Frank Diehl, Inostics GmbH, Hamburg
Pro Jahr erkranken rund 3,2 Millionen Menschen in Europa an Krebs – am häufigsten sind die
Lunge und der Dickdarm betroffen 1 . Krebs ist trotz heutiger Behandlungsmöglichkeiten eine
Krankheit mit oft tödlichem Ausgang. Die Situation ließe sich dramatisch verbessern, wenn
die Krankheit im Frühstadium entdeckt würde und die Behandlung besser auf den jeweiligen
Patienten abgestimmt werden könnte. Neben neuartigen bildgebenden Verfahren werden
daher zunehmend in vitro-Diagnostikansätze verfolgt, die auf der Analyse tumorspezifischer
genetischer und epigenetischer Marker im Blutplasma basieren. Im Unterschied zu etablierten
Diagnostikverfahren wird von den zielgerichteten molekularen Markern eine bessere
klinische Sensitivität und Spezifität sowie eine molekulare Charakterisierung des Tumors
für verbesserte Therapieentscheidungen erwartet. BEAMing ist eine neue Technologie, mit
der kleinste Mengen an tumorspezifischer DNA in Blutplasma quantitativ gemessen werden
können 2 . Dies ermöglicht es, Tumore in einem frühen Stadium nicht-invasiv zu detektieren
und unmittelbar den Behandlungserfolg einer Therapie abzuschätzen.
Die Erforschung der molekularen Grundlagen
der Tumorentstehung hat dazu geführt, dass
heute neue diagnostische Markerstrategien
entwickelt werden können. Diese bieten die
Möglichkeit, Tumorerkrankungen bereits in
einer frühen – und damit für die Heilung besten
Phase – zu entdecken. Weiterhin konnte
gezeigt werden, dass ein Zusammenhang
zwischen molekularen Eigenschaften der Tumoren
und dem Behandlungserfolg besteht,
was zunehmend eine Personalisierung der
Arzneimitteltherapie ermöglicht. Einer der
spezifischsten Tumormarker ist die Veränderung
der DNA-Sequenz, wie zum Beispiel
somatische Punktmutationen in Genen, die
direkt für die Entstehung von Krebs verantwortlich
sind. Weiterhin rückt die Entwicklung
von diagnostischen Tests auf Grundlage
von Blutplasma in den Fokus, da Blut einfach
und wiederholt gewonnen werden kann. Die
Detektion mutierter DNA-Moleküle im Blut
erscheint daher als außerordentlich attraktiver
diagnostischer Ansatz in der Onkologie.
Bisher gestaltete sich die praktische Anwendung
dieser Strategie allerdings schwierig, da
hierfür analytische Verfahren mit hoher Sensitivität
und Selektivität benötigt werden.
BEAMing-Technologie
Die BEAMing-Technologie ist eine hochsensitive
quantitative Technologie, die kleinste
Mengen mutierter oder methylierter DNA
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nachweisen kann, die zuvor vom Tumor in
das Blut abgegeben wurden und dort zirkulieren
3,5 . Die Abkürzung BEAMing steht dabei für
die Komponenten des Assays: Beads, Emulsion,
Amplification und Magnetics. Es handelt
sich bei dem Verfahren um eine gezielte Amplifikation
von DNA-Einzelmolekülen auf der
Oberfläche von magnetischen Mikropartikeln
(Beads) in einer Wasser-in-Öl-Emulsion 3 . Das
Resultat einer BEAMing-Reaktion ist somit
die Umwandlung einzelner DNA-Moleküle in
fluoreszierende Mikropartikel, welche mit Hilfe
der Durchflusszytometrie detektiert und
quantifiziert werden können. Der entscheidende
Amplifikationsschritt findet in den
Wassertröpfchen einer Emulsion statt und
kann somit millionenfach mit geringstem
Reagenzienverbrauch durchgeführt werden.
Dieser Ansatz ermöglicht heute eine Miniaturisierung,
bei der statt einer Reaktion pro
Gefäß mehr als 10 8 PCR-Reaktionen gleichzeitig
möglich sind. BEAMing ermöglicht eine
unabhängige Analyse der DNA-Sequenz, bei
der die techniche Sensitivität lediglich von
der Anzahl der eingesetzten DNA-Moleküle
abhängt. In der Anwendung hat sich eine
Sensitivität von 0.01%, das heißt dem Nachweis
von einem mutierten oder methylierten
DNA-Molekül in der Gegenwart von 10.000
Wildtyp-DNA-Fragmenten, als praktisch
erwiesen.
Die Detektion von Mutationen im Blutplasma
auf Basis der BEAMing-Technologie lässt
sich in mehrere Arbeitsschritte unterteilen
(Abb. 1 A):
Probenvorbereitung & Präamplifikation: Jede
Analyse beginnt mit der DNA-Isolierung aus
Blutplasma oder anderen klinischen Proben.
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