Reinigungsleistung von Membranbelebungsanlagen bezüglich ...

Reinigungsleistung von Membranbelebungsanlagenbezüglich hygienischer Parameter Seite 36Tabelle 7 Herkunft der Chemikalien und Medien für Comet Assay.Chemikalien Abkürzung FirmaAgarose mit niedrigem Schmelzpunkt LMP AgaroseInvitrogen Life TechnologiesPaisley, ScotlandAgarose mit normalem Schmelzpunkt NMP AgaroseInvitrogen Life TechnologiesPaisley, Scotland2-Amino-2-(hydroxy-methyl)-1.3 propandiol Tris Sigma, St. Louis, USAEthidiumbromid EtBr Sigma, St. Louis, USAt-Octylphenoxy-polyethoxyethanol Triton X-100 Sigma, St. Louis, USADimethylsulfoxid DMSO Merck, Darmstadt, DeutschlandTrypanblauSigma, St. Louis, USANatriumchlorid NaCl Merck, Darmstadt, DeutschlandMinimum Essential Medium Eagle MEM Sigma St. Louis, USANatriumhydrogencarbonat NaHCo 3 Merck, Darmstadt, DeutschlandKaliumchlorid KCl Sigma, St. Louis, USAN-2-Hydroxyethylpiperazine-N`-2-ethansulfonic acidHepesSigma St. Louis, USAKollagenase typ IVSigma St. Louis, USAGlucose C 6 H 12 O 6 Merck, Darmstadt, DeutschlandBenzalkoniumchlorid BAC (CAS-Nr. 8001-45-5) Sigma St. Louis, USA5.4.1.2 VersuchstiereFür die Herstellung der Hepatozytensuspensionen wurden männliche OFH Ratten (200-250 g)verwendet. Die Tiere wurden von der Abteilung für biomedizinische Forschung in Himberg (NÖ)bezogen und unter Standardbedingungen (Makrolon Käfige Typ II, 12 Stunden hell-dunkelRhythmus, 23±3°C) am Institut für Krebsforschung (Tierlabor) gehalten und mit Standardfutter(ssniff R/M-H) gefüttert. 24 Stunden vor Herstellung der Zellsuspensionen wurden die Tierenüchtern gesetzt, erhielten jedoch weiterhin Wasser ad libitum.5.4.1.3 Durchführung der Comet Assays mit primären RattenhepatozytenDie Leberzellen wurden mittels zweistufiger Kollagenperfusion isoliert (SEGELN, 1976) und inMinimal Essential Medium (MEM) von Sigma (St Louis, USA) und NaHCO 3 von Merck(Darmstadt, Deutschland) aufgenommen. BAC (St Louis, USA) wurde im Wasser (Proben ausVorlagetank VLT und Belebungsbecken BB) gelöst und nachfolgend mit Hepatozyten undMedium inkubiert (60 Minuten bei 37°C).Unmittelbar nach der Perfusion wurde die Vitalität der Zellen mit dem Trypanblau-Ausschlußverfahren bestimmt (LINDL und BAUER, 1994). Die Hepatozyten wurden inFalconröhrchen aufgenommen (250-300 µl pro Röhrchen) und 60 Minuten bei 37°C mit denWasserproben inkubiert. Nachfolgend wurden die Zellen mit Phosphatpuffer (PBS) gewaschen.Von der Zellsuspension wurden 20 µl zur Bestimmung der Vitalität verwendet. Die restlichenZellen wurden erneut zentrifugiert, in 100 µl Low Melting Point Agarose (Invitrogen LifeTechnologies, Paisley, Schottland) aufgenommen, und auf agarose-beschichtete Objektträgeraufgetragen. Lyse, Elektrophorese (20min., bei 4°C, 25V, 300 mA) und Färbung der Zellen mitEthidiumbromid wurden nach Singh et al. (1988) durchgeführt und die Kometenbildung mit einemFluoreszenzmikroskop (Nikon 27012, Quecksilberdampflampe Osram HB10101AF, Grünfilter520 nm, Objektiv Nikon Plan Flur 10X Vergrößerung) mittels computergestütztem Analysesystem(Perspective Instruments, UK) ausgewertet. Pro Messpunkt wurden 3 Kulturen behandelt, proKultur wurden 3 Objektträger hergestellt und pro Objektträger wurden 50 Zellen ausgewertet. AlsEndbericht Kapitel 5 April 2010