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SOLUZIONI
ANALITICHE
doppio sia nella piastra di estrazione sia nella strip di detection: nel
primo pozzetto sono presenti primers e sonda (molecular beacon)
speci ci per il patogeno, mentre nel secondo pozzetto avviene il controllo
dell’eventuale inibizione di reazione (sono assenti i primers e la
sonda speci ci del patogeno). Per ogni ciclo di analisi vengono inseriti
6 controlli di reazione forniti dal kit, costituiti da 3 controlli negativi (per
escludere contaminazioni), 2 controlli positivi (per vericare l’avvenuta
ampli cazione del DNA) ed 1 controllo di inibizione (per vericare
inibizioni dovute ad effetto matrice). Le strips, chiuse con gli specici
tappi ottici, vengono agitate prima manualmente, poi col vortex per
1 minuto, centrifugate per 1 minuto a 1.800 rpm ed inserite nel termociclatore
per 1 ora e 30 minuti. Le condizioni di reazione sono: 1
ciclo di attivazione di 15 minuti a 95°C e 40 cicli di denaturazione (15
secondi a 94°C), appaiamento (30 secondi a 55°C) ed estensione (15
secondi a 72°C). Al termine, a video, viene evidenziata la piastra con
i risultati. Se la reazione è avvenuta correttamente, i controlli risultano
evidenziati in verde. I campioni negativi vengono evidenziati in verde
mentre in rosso sono segnalati i campioni positivi ed in giallo gli eventuali
campioni non amplicati o dubbi, sui quali è necessario effettuare
ulteriori valutazioni (ripetizione dell’analisi ecc). Secondo la specica
del fornitore, il kit utilizzato permette l’amplicazione e quindi il rilevamento
di 166 ceppi di Salmonella. È interessante notare che, nel
caso in cui non sia possibile effettuare subito l’estrazione del DNA dai
campioni, aliquote di brodo arricchito possono essere mantenute in
frigo per una settimana. Anche i DNA estratti, se non immediatamente
amplicati, possono essere mantenuti in frigo per una settimana.
Risultati
Lo studio condotto dal Settore Biologico del Laboratorio Hera per la
validazione del metodo alternativo con tecnica PCR Real Time ha
previsto la valutazione di: sensibilità, specicità, limite minimo di rilevazione
(detection), corrispondenza dei risultati con il metodo di riferimento,
partecipazione a circuiti interlaboratorio.
Sensibilità e speci cità
La valutazione della tecnica PCR è iniziata con la verica della corretta
attribuzione all’esatto gruppo di appartenenza di campioni positivi e
negativi secondo quanto descritto nella Iso/Tr 13843 [6].
La sensibilità (frazione del numero totale di campioni positivi attribuiti
in modo corretto al gruppo di appartenenza) è stata determinata analizzando
campioni arti ciali preparati in laboratorio mediante l’impiego
di ceppi noti di Salmonella, provenienti da circuiti interlaboratorio o
dall’American Type Culture Collection (Atcc), elencati in Tabella 1A.
La speci cità (frazione del numero totale di campioni negativi attribuiti
in modo corretto) è stata valutata amplicando il DNA estratto da ceppi
noti non bersaglio (Tabella 1B). Le prove eseguite hanno evidenziato
come la tecnica ed il kit utilizzati siano estremamente sensibili
e speci ci: non si sono presentati casi di falsi positivi o falsi negativi,
neppure in presenza di microrganismi afni a Salmonella.
Prove di recupero e limite di rilevazione
Prove con coltura pura - Sono state effettuate diluizioni scalari del
ceppo Atcc 14028 di Salmonella typhimurium in brodo Brain Hearth
Infusion (Bhi) in modo da ottenere soluzioni contenenti valori teorici
da 100 a 0,01 Unità Formanti Colonia (UFC)/10 l: si è ottenuta
A
Ceppo batterico Provenienza Risultato PCR
Salmonella typhimurium Atcc 14028 Collezione Hera Presente
Salmonella typhimurium Atcc 14028 a titolo noto
Salmonella oranienburg
Prova interlab. Lgc
Salmonella infantis
Afnor
Salmonella abony
Prova interlab. Senate
Salmonella nottingham
Prova interlab. Unichim
B
Ceppo batterico Provenienza Risultato PCR
Enterococcus faecalis Atcc 29212 Collezione Hera Assente
Escherichia coli Atcc 25922
Sta lococcus aureus Atcc 25923
Escherichia coli Prova interlab. Unichim 4
Klebsiella pneumoniae
Escherichia coli Atcc 13706
Collezione Hera
Pseudomonas aeruginosa Atcc 27853
Escherichia coli
Senate
Escherichia coli Prova interlab. Senate 04
Escherichia coli Nctc 9001 Prova interlab. Unichim 5
Prove con coltura pura
Prove con campioni
articiali
Valore nominale (UFC)
Tabella 1 - Controlli di qualità con ceppi certicati.
Prove di recupero
Tradizionale YEA
(UFC)
Tradizionale HEA
(UFC)
un segnale positivo in PCR no alla concentrazione di 0,1 UFC. Si
è proceduto quindi ad eseguire un’altra serie di prove per veri care
il recupero nell’intervallo da 1 a 0,1 UFC (teorico), comparando
il metodo tradizionale con la PCR real time. Sono state analizzate
in PCR 4 repliche della soluzione contenete 1 UFC, 7 repliche della
soluzione contenente 0,5 UFC e 4 repliche di quella contenente 0,1
UFC. Contemporaneamente sono stati eseguiti strisci multipli delle 3
soluzioni su terreno nutritivo non selettivo Yeast Extract Agar (YEA) e
su terreno selettivo Hektoen Enteric Agar (HEA). Come si può vedere
in Tabella 2, con la PCR alla concentrazione teorica di 0,1 UFC si è
ottenuta una positività nel 75% dei casi mentre in YEA solo nel 25%
dei casi e in HEA, più selettivo, nello 0% dei casi. Alle concentrazioni
di 1 e 0,5 UFC/10 l la PCR Real Time ha dato il 100% di positività al
contrario degli altri metodi. Le prove eseguite hanno quindi evidenziato
come la tecnica alternativa utilizzata sia molto sensibile: il segnale
PCR
1 1 0 Presente
1 1 0
1 1 0
1 1 1
0,5 0 0 Presente
0,5 0 0
0,5 0 0
0,5 0 0
0,5 0 0
0,5 0 0
0,5 0 0
0,1 0 0 Presente
0,1 1 0
0,1 0 0
0,1 0 0 Assente
0,5 UFC/100 ml 0 0 Presente
0,1 UFC/100 ml 0 0 Assente
0,05 UFC/100 ml 0 0 Assente
0,01 UFC/100 ml 0 0 Assente
Tabella 2 – Prove di recupero con colture pure e campioni articiali.
48 n.1 marzo 2011
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