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Limite di rivelazione: acqua sterile contaminata con ceppo certicato di Salmonella typhimurium
Valore
nominale
N° Repliche
N° Risultati positivi
PCR
N° Risultati negativi
PCR
di ampli cazione si avvicina al limite teorico di 0,1 UFC. Un’ulteriore
prova con dieci repliche di un campione di acqua sterile contaminata
con 0,5 e 0,1 UFC di ceppo certicato, ha confermato che il limite di
rilevazione (95% di repliche positive) si attesta tra queste due concentrazioni
(Tabella 3).
Prove con campioni articiali - Per valutare anche l’effetto matrice
le prove sono state eseguite utilizzando campioni articiali costituiti
da 100 ml di acqua superciale, risultata negativa con la tecnica tradizionale
e la tecnica PCR, contaminata con il ceppo Atcc 14028 di
Salmonella typhimurium; si è operato in modo da avere bassi livelli
Note
0,5 10 10 0 Campioni positivi = 100%
0,1 10 7 3 Campioni positivi = 70%
Limite di rivelazione: Matrice super ciale contaminata con ceppo certi cato
di Salmonella typhimurium
Valore
N° Risultati positivi N° Risultati negativi
N° Repliche
nominale
PCR
PCR
Note
0,5 20 20 0 Campioni positivi = 100%
0,1 20 11 9 Campioni positivi = 55%
Tabella 3 - Limiti di rilevazione.
Confronto metodi: metodo di riferimento tradizionale con HEA (Apat Irsa Cnr 7080) vs PCR - RT
N°campioni Matrice campione Metodo tradizionale HEA PCR-Rt
1 Acqua potabile Assente Assente
2 Assente Assente
3 Assente Assente
4 Assente Assente
5 Assente Assente
6 Acqua naturale profonda Assente Assente
7 Assente Assente
8 Assente Assente
9 Acqua naturale super ciale Presente Presente
10 Presente Presente
11 Presente Presente
12 Presente Presente
13 Assente Assente
14 Presente Presente
15 Assente Presente
16 Assente Assente
17 Assente Assente
18 Assente Assente
19 Assente Assente
20 Assente Assente
21 Assente Presente
22 Re ua Presente Presente
23 Presente Presente
24 Assente Assente
25 Assente Assente
26 Assente Assente
27 Assente Assente
28 Assente Assente
29 Assente Assente
30 Assente Assente
31 Assente Assente
32 Assente Presente
33 Assente Assente
34 Assente Assente
35 Assente Presente
36 Assente Assente
37 Presente Presente
Tabella 4 - Confronto tra il metodo tradizionale con isolamento
in HEA e PCR Real Time.
di contaminazione (numero teorico compreso tra 0,01 e 0,5 UFC/100
ml). Al termine dell’arricchimento un‘aliquota del brodo è stata prelevata
per l’analisi con PCR Real Time e un’altra aliquota è stata utilizzata
per l’analisi tradizionale, eseguita utilizzando per l’isolamento
sia il terreno nutritivo non selettivo YEA che il terreno selettivo HEA.
I risultati ottenuti indicano che solo la PCR rileva la presenza di Salmonella
alla concentrazione teorica di 0,5 UFC (Tabella 2). Anche nel
caso di campioni articiali è stata effettuata l’analisi con la tecnica
PCR di venti repliche a diverse concentrazioni (0,5 e 0,1 UFC) e si
è potuto rilevare che il limite di rilevazione (95% repliche positive) si
attesta tra queste due concentrazioni (Tabella 3).
Corrispondenza tra metodo tradizionale e PCR
Sono stati analizzati in parallelo 37 campioni di varie matrici (acque
super ciali, potabili, profonde e reue) per confrontare il metodo PCR
in esame con il metodo classico comunemente impiegato per il rilevamento
di Salmonella nelle acque.
Come si può osservare in Tabella 4, si è ottenuta corrispondenza tra
tecnica tradizionale e PCR nel 89% dei campioni; nel restante 11%
(4 campioni) si sono ottenuti risultati positivi con PCR e negativi col
metodo tradizionale, a conferma del maggior recupero della PCR, già
evidenziato con le prove precedentemente descritte.
Prove interlaboratorio
La Uni Cei En Iso/Iec 17025:2005 [5], p 5.4.5, comprende i confronti
interlaboratorio tra le tecniche utilizzate per la determinazione delle
prestazioni di un metodo ai ni della validazione.
La partecipazione ai cicli di Prove interlaboratorio “Agenti microbiologici
nelle acque di scarico” gestite da Unichim, “Quality in Water
Analysis scheme” gestite da Lgc e “Senate Water Microbiology scheme”
gestite da Did ha prodotto risultati pienamente soddisfacenti (Tabella
5).
Conferma colturale dei campioni positivi in PCR
Tutti i brodi di prearricchimento derivati da campioni reali risultati positivi
con PCR Real Time (no ad oggi 38 campioni) sono stati isolati
per conferma su terreno selettivo agarizzato (HEA) e le colonie sospette
sono state confermate dalla presenza di C8 esterasi tramite
reattivo al 4-metil umbelliferil caprilato. Con queste prove di conferma
riguardanti 6 campioni di acqua naturale-profonda, 23 campioni di
acqua superciale e 9 re ui di depurazione, si è ottenuta una corrispondenza
del risultato nel 100% dei casi.
Conclusioni
Oltre a dare ottimi risultati, la tecnica di PCR Real Time, utilizzando
il kit “Adiafood Rapid-Pathogen Detection system for Salmonella” di
Aes Chemunex e il termociclatore Stratagene Mx3005P, ha consentito
di disporre dell’esito dell’analisi di campioni di acqua di diverse provenienze
(superciali, potabili, profonde, reue) con notevole anticipo
rispetto alla metodica tradizionale. Ricordiamo infatti che quest’ultimo
necessita per la risposta di 4 giorni nel caso di assenza di Salmonella
e di 6-7 giorni lavorativi in caso di campioni con esito positivo; sono
necessari inoltre test di conferma che richiedono terreni selettivi e test
biochimici e/o sierologici, con fasi a cadenza giornaliera.
Tali operazioni di conferma non sono necessarie nel caso dell’impie-
n.1 marzo 2011
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