Prevalência de resistência a antimicrobianos em isolados ...

2.6. Transconjugações
Ana Martins
As transconjugações foram realizadas de acordo com as experiências desenvolvidas por
Wang e colaboradores (2004). Estirpes de E. coli J53AzR foram utilizadas como
recetoras e as estirpes E. coli com fenótipo de resistência a AMP como dadoras. As
estirpes recetoras foram incubadas overnight a 37ºC com agitação, em meio de TSB
com 100μg/mL de azida de sódio e as dadoras em meio de TSB com 50μg/mL de
ampicilina. Posteriormente colocou-se 0,5mL de cada estirpe num tubo com 4mL de
TSB sem enriquecimento e incubou-se overnight a 37ºC sem agitação. Efetuou-se o
isolamento das estirpes de E. coli J53AzR com plasmídeo resistente em meio de TSA
enriquecido com 100µg/mL de azida sódica, 50µg/mL de ampicilina e cicloheximida.
2.7. Biologia Molecular
2.7.1. Extração DNA total de E.coli
Na extração de DNA total de E. coli inoculou-se as estirpes em 10mL de meio de TSB
que incubou overnight a 37ºC. Transferiu-se 1,5mL do inóculo para um microtubo e
centrifugou-se a 5000 rpm durante 5 minutos. Rejeitou-se o sobrenadante e repetiu-se os
passos anteriores com o objetivo de concentrar o pellet. Rejeitar o sobrenadante e
ressuspender em 750μL de STE adicionando-se posteriormente 60μL de SDS a 10%
com leve agitação. Incubar em banho-maria a 56ºC durante 10 minutos. Arrefecer a
temperatura ambiente e adicionar 500μL de fenol – clorofórmio 1:1 e agitar no vórtex
observando-se uma solução branca. Centrifugar a 10000rpm durante 5 minutos. Vai-se
observar a formação de uma fase aquosa no cimo do tubo, uma fase intermédia onde se
encontram as proteínas desnaturadas e uma fase fenólica onde se concentram outras
moléculas. Retira-se 500μL da fase aquosa para outro microtubo ao qual se adiciona
100μL de 5M NaCl e 900μL de etanol absoluto a -20ºC para precipitar os ácidos
nucleicos. Centrifugar a 10000 rpm durante 5 minutos e rejeitar o sobrenadante.
Lavagem dos precipitados com 100μL de etanol a 70% a -20ºC. Centrifugar novamente
a 10000 rpm 5 minutos e rejeitar o sobrenadante. Deixar secar a temperatura ambiente
durante 30 minutos ou incubar a 37ºC durante 5 minutos. É importante que toda a
quantidade de etanol evapore totalmente para o DNA não ficar com partículas voláteis o
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