Aspectos Legais para Abertura de Laboratórios de ... - NewsLab

semeados em placas de ágar sangue de
carneiro a 5% para checar sua pureza
e repicadas para tubos contendo caldo
Todd-Hewitt (Difco).
Estoques das cepas foram mantidos
a -70 o C em caldo Todd-Hewitt.
A reativação das cepas do estoque
ocorreu em caldo BHI (Difco) com
incubação aeróbica a 35 o C. Após 18
horas as amostras foram repicadas
em placas de ágar sangue de carneiro
a 5%, reincubadas aerobicamente a
35 o C durante 24 horas e estas foram
utilizadas para a realização de todos
os testes (8).
Testes fisiológicos
a) Triagem: tubos de poliestireno
estéreis com 2 mL de meio de
triagem, denominado ágar esculinasal-azida
e outros contendo 1 mL de
ácido piroglutâmico β-naftilamida a
0,01% em caldo Todd-Hewitt (Difco)
foram utilizados para triagem dos enterococos
(29). O meio de triagem foi
desenvolvido a partir dos estudos de
Qadri et al. (23) modificado em nosso
laboratório para obtenção de resultados
positivos em menor tempo (1 a 2
horas). O meio de esculina possui a
seguinte formulação: esculina monohidratada
(2,0 g), citrato férrico amoniacal
(0,05 g), NaCl (65,0 g), peptona
de caseína (10,0 g), azida sódica (0,2
g) e ágar (13,0 g) em 1.000 mL de
água deionizada. Ambos os meios de
triagem foram esterilizados a 121 o C
durante 15 minutos antes de serem
colocados assepticamente nos tubos
de poliestireno, estes previamente
esterilizados por óxido de etileno. Todas
as cepas testadas (incluindo os S.
bovis) foram inoculados nestes caldos,
perfazendo suspensões com turbidez
equivalente ao tubo 3 da escala de
MacFarland e incubados em estufa
bacteriológica a 35 o C durante 1 a 2
horas. Após este período, as bactérias
A
A) Meio sem inocular
B) E. gallinarum após 1hora de
incubação a 35-37 o C
C) E. gallinarum após 2 horas de
incubação a 35-37 o C
Figura 1. Reações dos enterococos no ágar
esculina-sal-azida
A
B
Figura 2. Reações dos enterococos
no meio contendo ácido piroglutâmico
ß-naftilamida
que apresentaram coloração preta no
ágar esculina-sal-azida (Figura 1) e
hidrolisaram o PYR (aparecimento de
coloração vermelha (Figura 2) após a
adição de uma gota de p-dimetilaminocinamaldeído)
foram consideradas
presuntivamente como pertencentes
ao gênero Enterococcus.
b) Série bioquímica miniaturizada
desidratada: Cocos Grampositivos,
catalase(-), cujos meios
B
A) E. faecalis (reação positiva)
B) S. bovis (reação negativa)
C
apresentaram triagem positiva para
enterococos foram então inoculados
no sistema miniaturizado proposto.
Este sistema consiste em uma base
plástica (placa de poliestireno estéril
de 96 cavidades com fundo “U”)
contendo os substratos desidratados
(kit denominado Enterococcus-ID).
Escolhemos as provas que melhor
diferenciassem as espécies de enterococos
para a composição deste kit
(hidrólise da arginina, fermentação
de arabinose, sorbitol, rafinose, lactose,
sacarose e manitol). Os substratos
foram desidratados (Figura
3) através de procedimento criado
em nosso laboratório. O caldo para
a fermentação dos carboidratos foi
formulado em nosso laboratório,
consistindo em: peptona de caseína
(10,0 g), extrato de levedura (3,0
g), NaCl (5,0 g), vermelho de fenol
(0,02 g), carboidrato (10,0 g), água
deionizada (1.000mL). A solução foi
aquecida para a dissolução de todos
os ingredientes e o pH foi ajustado a
7,8 com solução de NaOH 1M. Todas
as soluções foram esterilizadas por
filtração (filtro de 0,22 µm, Millipore).
Todos os isolados clínicos e as cepas
de controle de qualidade foram inoculados
em triplicata e incubados em
estufa bacteriológica regulada a 35 o C
durante 18-24 horas e os resultados
foram interpretados e registrados
(Figura 4).
c) Provas bioquímicas convencionais:
Foram utilizados os
testes tradicionais empregados pela
maioria dos laboratórios clínicos (ágar
bile-esculina [Difco], caldo arginina
dehidrolase segundo Moeller [Difco] e
caldo nutriente [Merck] com 6,5% de
NaCl). Todos os isolados clínicos e as
cepas de controle de qualidade foram
inoculados em triplicata e incubados
em estufa bacteriológica regulada a
35 o C durante 18-24 horas.
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NewsLab - edição 89 - 2008