View/Open - JUWEL - Forschungszentrum Jülich

8.2. Lösungsmittelscreening
& Tramper, 1995; Bauer et al., 1999; Rosche et al., 2002). Weiterhin ist in vielen
Fällen nicht nur die Natur des verwendeten Lösungsmittels verantwortlich für die Enzymdesaktivierung
in organisch / wässrigen Zweiphasensystemen. Viele Mechanismen,
wie z.B. physikalische Kräfte an der Phasengrenzfläche, können die Enzymaktivität
ebenfalls beeinflussen (Halling, 1987). Um bei der Suche nach einem geeigneten Lösungsmittel
für die BAL möglichst viele Einflüsse zu berücksichtigen, wird das Screening
in zwei Schritten durchgeführt. Im ersten Schritt des Lösungsmittelscreenings
wird die Stabilität der BAL in Kombination mit Vertretern verschiedener Lösungsmittelklassen
untersucht. Hier kommen auch Lösungsmittel zum Einsatz, die nach
dem log P-Konzept für die Verwendung mit Biokatalysatoren nicht geeignet scheinen.
Ziel des ersten Screening ist es, eine für die BAL geeignete Lösungsmittelklasse
zu finden. In einem zweiten Lösungsmittelscreening werden anschließend verschiedene
Lösungsmittel aus der zuvor bestimmten Lösungsmittelklasse getestet. Das im zweiten
Screening gefundene Lösungsmittel wird dann für die Biotransformationen im
organisch / wässrigen Zweiphasensystem eingesetzt.
8.2.1. Lösungsmittelklassen
Im ersten Lösungsmittelscreening werden Ethylacetat, Diethylether und die halogenierten
Kohlenwasserstoffe Di- und Trichlormethan verwendet. Cyclohexan kommt als
Vertreter cyclischer Kohlenwasserstoffe zum Einsatz. Die aromatischen Lösungsmittel
werden durch Toluol und p-Xylol vertreten. 1-Oktanol kommt als primärer Alkohol
zum Einsatz. Weiterhin sind die verzweigten Kohlenwasserstoffe Isohexan und Isoheptan
sowie n-Heptan als unverzweigter Kohlenwasserstoff beteiligt. Tabelle 8.1 auf der
nächsten Seite zeigt die verwendeten Lösungsmittel und ihre Strukturformeln nach
aufsteigendem log P-Wert sortiert 2 .
Das Vorgehen bei den Stabilitätsmessungen war für jedes Lösungsmittel gleich. Dazu
wurde das Enzym zunächst in Kaliumphosphatpuffer gelöst, der auch den Cofaktor
Thiamindiphosphat und Magnesiumionen enthielt. Nachdem die Startaktivität des
Enzyms bestimmt wurde, wurde das gleiche Volumen des zu testenden Lösungsmittels
zugesetzt. Um Volumenänderungen der Phasen zu vermeiden, wurde das Lösungsmittel
vor der Zugabe mit Wasser gesättigt. Durch intensives Rühren (700 U/min) wurde
eine Emulsion beider Phasen erzeugt. Nach fünf Minuten wurde die erste Probe aus
des wässrigen Phase entnommen und die Enzymaktivität unter Standardbedingungen
bestimmt 3 . Die Differenz zwischen Startaktivität und der Enzymaktivität nach
fünf Minuten gibt Aufschluss über eine mögliche Inhibierung des Enzyms durch eine
Restkonzentration des organische Lösungsmittels in der wässrigen Phase. Die Abnahme
der Enzymaktivität im weiteren Verlauf des Versuchs wurde durch regelmäßige
Beprobung der wässigen Phase dokumentiert. Um die thermische Desaktivierung des
Enzyms zu minimieren wurden alle Versuch zur Lagerstabilität der BAL im organisch
/ wässrigen Zweiphasensystem bei 4 ◦ C durchgeführt. Im Kontrollexperiment wurde
2Die log P-Werte wurden nach der Crippenschen Fragmantierungsmethode berechnet (Ghose &
Crippen, 1987).
3Vergleiche hierzu Kapitel 3.1 auf Seite 21.
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