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12. Material und Methoden 12.1. Geräte Bruker Analytische Meßtechnik, Rheinstetten NMR spectrometer AMX-300 Bronkhorst B.V (Niederlande) Massenflussmesser Büchi, Constanz, Schweiz Membranpumpen vacubrand, Wertheim Membranpumpen IKA Laboratoriumstechnik, Staufen Magnetrührer Millipore YM10 Ultrafiltrationsmembranen Verder, Düsseldorf Hamilton (via Zahnradpumpen Chromatographie Service, Langerwehe) Spritzen Werkstätten des Forschungszentrums diverse Glasgeräte JASCO, Groß-Umstadt HPLC-Anlage Sycam, Gauting HPLC-Anlage Agilent Technologies, Heilbronn Gaschomatograph 6890 Amersham Pharmacia Biotech P500 Wechselkolbenpumpe Swagelock (B.E.S.T., Köln) Klemmringverschraubung und Ventile Celgard, Norderstedt Celgard X50 (Liquicel Minimodule) Pharmacia LBK, Freiburg Säulen Amicon, Düsseldorf Ultrafiltrationszelle CS Chomatigraphieservice, Langerwehe diverse Glassgeräte Branson, via Gerhard Heinemann Laboratoriums- Ausrüstung, Schwäbisch-Gemünd Sornifiert Beckman Coulter Zentrifuge GS15-R Shimadzu, Duisburg Spektrophotometer UV160 Satorius, Göttingen Analysenwaage BP 211-D Metrohm, Herisau (Schweiz) pH-Meter 691; pH-Elektrode InLab 421 Labsystems, Frankfurt Finnpipette Eppendorf, Hamburg Centrifuge 5415 D Merck, Darmstadt LiChrosphere 250x4 mm 100 RP-8 HPLC-Säule, Dacielle Chiracel OD-H HPLC Säule 123
12. Material und Methoden 12.2. Chemikalien Alle verwendeten Chemikalien waren mindestens von analytischer Qualität (p.a.) und wurden soweit nicht anders angegeben von Fluka, Sigma oder Merck bezogen. Die verwendeten Aldehyde wurden als Redestillate eingesetzt und mittels Schlenk-Technik unter Argon aufbewahrt. Thiamindiphosphat Merck, Darmstadt Ni-Nitrilo-tri-Essigsäure (NTA) Qiagen GmbH, Hilden Coomassie Brilliant Blue G250 Bio-Rad, München NAD + , NADH Jülich Fine Chemical, Jülich 12.3. Aufreinigung der Benzaldehydlyase Bei der in dieser Arbeit verwendeten Benzaldehydlyase handelt es sich um ein rekombinantes Protein, das als Hexahistidinfusionsprotein in E.coli überexpremiert wurde. Die genaue Bezeichnung des Stamms lautet E.coli SG13009 / BALHIS. Aufschlusspuffer (2 L) Waschpuffer (1 L) 50 mM KPi, pH = 7 50 mM KPi, pH = 7 2mMMgSO4 2mMMgSO4 0,1mMThDP 0,1mMThDP 50 mM Imidazol Elutionspuffer (1 L) Entsalzungspuffer (1 L) 50 mM KPi-Puffer, pH = 7 10 mM KPi-Puffer, pH = 6,5 2mMMgSO4 2mMMgSO4 0,1mMThDP 0,1mMThDP 250 mM Imidazol Alle Lösungen müssen vor Verwendung mit Helium entgast werden. Durch die Zugabe von Imidazol in die Pufferlösung steigt der pH-Wert an. Im Laufe der Arbeiten hat sich herausgestellt, dass sich nur dann befriedigende Proteinausbeuten erzielen lassen, wenn der pH-Wert nicht wieder auf den ursprünglichen Wert gebracht wird. Dabei ist jedoch zu beachten, dass das Enzym bei einem höheren pH-Wert eine geringere Stabilität aufweist. Die Exposition des Enzyms in diesen Löungen sollte daher möglichst kurz sein. Zellaufschluss Für den Zellaufschluss werden ca. 20 g E.coli Zellenin80mLAufschlusspuffer und einer Spatelspitze Lysozym durch vorsichtiges Rühren 40 Minuten suspendiert. Der Aufschluss erfolgt unter Eiskühlung durch gepulsten Ultraschall (Sornifier). Es werden 3 - 4 Intervalle (5 min) mit dazwischen liegenden Kühlintervallen (5 min) durchgeführt. Anschließend werden die Zellfragmente durch Zentrifugation abgetrennt (30 min, Rotor CO650, 4 ◦C, 10000 UpM). Immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie (IMAC) Die immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie (IMAC) stellt einen besonderen Fall 124
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Enantioselektive C-C Knüpfung mit
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Forschungszentrum Jülich GmbH Inst
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Für Alexandra
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Charakterisierung und reaktionstech
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Characterization and reaction engin
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Inhaltsverzeichnis I. Allgemeiner T
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Inhaltsverzeichnis 7. Einleitung 81
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Abbildungsverzeichnis 1.1. Möglich
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Abbildungsverzeichnis 7.1. Systeme
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Tabellenverzeichnis 4.1. Kinetische
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Abkürzungen und Symbole Abk. Abkü
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Abk. Abkürzung ttn maximale Zyklen
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Teil I. Allgemeiner Teil 1
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1. Einleitung dungen herausgestellt
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1. Einleitung tive Oxidation von En
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1. Einleitung Falle von Benzaldehyd
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1. Einleitung Die BAL weist bei den
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1. Einleitung 14
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2. Motivation und Zielsetzung O H O
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2. Motivation und Zielsetzung 18
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3. Systemcharakterisierung Bei der
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Enzymaktivität / U · mL −1 0,10
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Enzymaktivität / U · mL −1 0,08
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• erschwerte Produktaufarbeitung.
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3.5. Puffersystem Die Anwesenheit d
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3.6. Zusammenfassung und Auswahl de
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4. Kinetik Dieses Kapitel hat die k
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4.1. Auswahl der Einzelreaktionen 4
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4.2. Bestimmung der kinetischen Par
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BZ-Bildung / U mL −1 0,16 0,12 0,
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Parameter Wert Fehler Einheit vmax2
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HPP-Bildung / U mL −1 0,016 0,012
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4.2.5. HPP-Bildung O H + O H 4.2. B
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4.3. Zusammenfassung bildungsrate z
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5. Biotransformationen im homogenen
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mit τ = Verweilzeit. 5.1. Diskonti
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5.1. Diskontinuierliche Reaktionsf
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Produkt Ultrafiltration =Enzym Bef
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Satzreaktor (Batch) Konzentration K
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5.2.3. Simulation des EMR 5.2. Kont
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Umsatz / - 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 Umsa
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5.2. Kontinuierliche Reaktionsführ
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Fluss / mL h −1 60 50 40 30 20 10
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5.4. Zusammenfassung • Im Satzrea
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6. tert-Butylmethylether als Cosolv
Seite 100 und 101: 6.3. Satzreaktor Sowohl MTBE als au
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Seite 104 und 105: 6.5. Zusammenfassung 100 h) zurück
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Seite 109 und 110: 7. Einleitung • rein organische S
Seite 111 und 112: 7. Einleitung die große Phasengren
Seite 113 und 114: 7. Einleitung Aufgrund der Ähnlich
Seite 115 und 116: 7. Einleitung 88
Seite 117 und 118: 8. Untersuchungen zur Stabilität d
Seite 125 und 126: 9. Biotransformationen im Zweiphase
Seite 138 und 139: 10. Diskussion und Ausblick 10.1. H
Seite 140 und 141: 10.2. Reaktionen im Zweiphasensyste
Seite 142 und 143: 10.3. Vergleich zwischen einphasige
Seite 144 und 145: 10.3. Vergleich zwischen einphasige
Seite 146 und 147: 11. Zusammenfassung Die enantiosele
Seite 148 und 149: • Für Biotransformationen im Zwe
Seite 152 und 153: 12.4. Arbeitsvorschriften für das
Seite 154 und 155: 12.4. Arbeitsvorschriften für das
Seite 156 und 157: 12.6. Analytik kontinuierliche Emul
Seite 158: Teil V. Anhang 131
Seite 161 und 162: A. Modelle für die Simulation A.2.
Seite 163 und 164: Literaturverzeichnis Bauer, M., Gri
Seite 165 und 166: Literaturverzeichnis Faber, K. 1994
Seite 167 und 168: Literaturverzeichnis Janzen, E. 200
Seite 169 und 170: Literaturverzeichnis Liese, A., See
Seite 171 und 172: Literaturverzeichnis Stermitz, F. R
Seite 173 und 174: Literaturverzeichnis Zelinski, T.,
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