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scientia halensis 4/2002 .................................................................................... Fachbereich Biologie Abb. 2: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von Schließzellen aus transgenen Pflanzen, die (a) GFP bzw. (b) ein Fusionsprotein aus einem Transitpeptid und GFP exprimieren ................................................................................ der dieser Komplexe besteht aus kerncodierten und chloroplastencodierten Unter- 32 einheiten, was die notwendige Kooperation dieser beiden Genome nochmals unterstreicht. In unserer Arbeitsgruppe beschäftigen wir uns vor allem mit den kerncodierten Proteinen der Thylakoidmembran. Diese werden außerhalb des Chloroplasten im Cytosol der Pflanzenzelle synthetisiert und anschließend in das Organell importiert. Das erfordert ein spezifisches Transportsignal (Transitpeptid) im Protein sowie einen entsprechenden Importapparat im Chloroplasten. Nach dem Transport über die Chloroplastenhülle werden die Proteine weiter zu den Thylakoiden transportiert und schließlich in der Thylakoidmembran zusammen mit den plastidencodierten Untereinheiten sowie den Pigmenten und Cofaktoren zu funktionellen Photosynthesekomplexen zusammengebaut. Zur Untersuchung dieser Transport- und Assemblierungsvorgänge stützen wir uns vor allem auf zwei methodische Ansätze. (1) in vitro Versuche: Dazu werden Proteine »im Reagenzglas« synthetisiert, mit isolierten Chloroplasten oder Thylakoiden inkubiert und auf ihr Transport- und Assemblierungsverhalten hin untersucht. Da wir die Gene zu diesen Proteinen kloniert haben, stehen uns sämtliche Methoden der Gentechnik zur Mutagenese zur Verfügung, so dass wir nicht nur die authentischen, sondern auch alle Arten von modifizierten Proteinen herstellen und analysieren können. (2) in vivo Analysen: Hier untersuchen wir vor allem Pflanzen, die in ihrer Transport- und Assemblierungsmaschinerie verändert wurden und die darüber hinaus gut detektierbare Reporterproteine tragen, deren Transportverhalten auch in der intakten Pflanze genau verfolgt werden kann. Abb. 2 zeigt beispielhaft Aufnahmen von Pflanzen, die ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) aus Meeresquallen (mit bzw. ohne ein Chloroplasten-dirigierendes Transitpeptid) exprimieren. Mit Hilfe solcher Untersuchungen konnte in den letzten Jahren unter anderem gezeigt werden, dass allein schon für den Transport der Proteine über die Thylakoidmembran mindestens vier unterschiedliche Transportwege benötigt werden, die jeweils spezifisch nur bestimmte Proteine transportieren können (Abb. 3). Jeder dieser Wege arbeitet dabei mit einem anderen Mechanismus und verwendet vollkommen eigenständige Transportsignale und Transportapparate. Wie bereits dieses eine Beispiel illustriert, wird die Assemblierung der Photosynthesemembran durch eine Vielzahl ineinandergreifender Synthese-, Transport-, Sortierungs-, Faltungs-, Modifikations- und Prozessierungsmechanismen gesteuert. Die Aufklärung dieser Mechanismen ist das Hauptziel unserer Arbeit, dessen endgültiges Erreichen in Anbetracht der immensen Komplexität des Gesamtprozesses allerdings noch viel Zeit in Anspruch nehmen dürfte. Der Autor ist seit 1998 Professor am Institut für Pflanzenphysiologie im Biologicum der Martin-Luther-Universität in Halle. Vorherige wissenschaftliche Stationen waren Köln, Strasbourg (Frankreich) und München. Abb. 3: Schema der vier Proteintransportwege über die Thylakoidmembran
.............................................................................. scientia halensis 4/2002 Fachbereich Biologie GENSILENCING UND DIE ANALYSE VON REGULATIONSPROZESSEN IM CHROMATIN Gunter Reuter, Rainer Dorn, Gunnar Schotta, Anja Ebert, Kathrin Naumann, Andreas Fischer und Thomas Rudolph ............................................................................... Genetische Information wird auf engstem Raum verpackt. Bei mehreren Organismen wurde in den letzten Jahren die DNA-Sequenz des Genoms ermittelt. Hierzu gehören z. B. die im Drosophila-Modell beeinflussen, kön- in Genen, die ein Silencing des white-Gens 33 Taufliege Drosophila melanogaster, die Maus, die Ackerschmalwand Arabidopsis thaliana nen leicht erkannt werden. Die Tiere haben und auch der Mensch. Dadurch konnte die Zahl der Gene dieser Organismen genauer vorher dann normal rote statt weiß-rot gefleckte gesagt werden. Augen. Durch die Isolation und Charakteri- sierung von mehr als 400 Mutationen dichtere Verpackung der DNA durch Heterochromatisierung. konnten wir etwa 150 neue Gene beschreizess Ein vergleichbarer Proben, die bei Drosophila Gensilencing kon- wird auch beim Modellobjekt Drosophila trollieren. Von diesen 150 Genen konnten gefunden. Hier wird beobachtet, dass bisher etwa 20 in ihrer molekularen Wirtrollieren. Gene still gelegt werden, wenn sie in unmittelbare kung aufgeklärt werden. Unsere Arbeitshymatin Nachbarschaft von Heterochropothese hat sich bestätigt. Die Produkte verlagert werden (Abb. 1). Im Mo- dieser Gene haben wichtige Funktionen bei Der Mensch besitzt etwa 40 000 Gene, die auf DNA-Molekülen mit einer Gesamtlänge von ca. 1m untergebracht sind. Im Kern einer diploiden menschlichen Zelle sind 46 Chromosomen vorhanden. Da diese nur wenige Mikrometer groß sind, ergibt sich die Notwendigkeit einer extrem dichten Verpackung der DNA. Zugleich muss aber die Regulierbarkeit und Aktivität der Gene gewährleistet sein. Die Verpackung der DNA erfolgt über mehrere, hierarchisch aufeinanderfolgende Stufen. Das Nukleosom bildet bei allen Eukaryoten die Grundeinheit und enthält jeweils zwei Moleküle der Histonproteine H2A, H2B, H3 und H4. Die DNA bindet an dieses Proteinoktamer, indem sie in ca. 1,75 Windungen herumgewickelt wird. Anschließend bindet ein weiteres Histon (H1) jeweils zwei benachbarte Nukleosomen und führt so zu einer zusätzlichen Verdichtung. Höhergeordnete Schleifenstrukturen dieser Nukleosomenkette bewirken die weitere Kondensation. Die maximale Verpackung wird während der Zellteilung erreicht, wenn die Chromosomen sichtbar werden. Demgegenüber müssen die Chromosomen für die Realisierung der genetischen Information (Ablesen der Gene) so dekondensiert werden, dass eine Zugänglichkeit durch die dafür notwendigen Werkzeuge möglich ist. Die damit verbundenen Prozesse, welche vor allem höhergeordnete Strukturen kontrollieren, sind noch weitgehend unbekannt. Die Aufklärung der Kontrolle dieser Verpackungsstrukturen ist ein Schwerpunkt unserer Arbeiten. Viele Gene müssen in der Entwicklung stillgelegt werden: Mann und Frau unterscheiden sich in der Zahl der X-Chromosomen. Männer haben nur ein X-, während Frauen zwei X-Chromosomen besitzen. Frauen haben somit die doppelte Anzahl X-chromosomaler Gene und würden damit auch die doppelte Menge an entsprechenden Genprodukten bilden, wenn nicht eine Korrektur erfolgt. Diese besteht darin, dass alle Gene auf einem der beiden X-Chromosomen total stillgelegt werden. Dieser Prozess wird Gensilencing genannt und erfolgt über eine Abb. 1: Silencing des white-Gens bei Drosophila. (a) Die Verlagerung des white-Gens ans Heterochromatin führt zur (b) Inaktivierung des white-Gens durch Gensilencing im Drosophila-Auge (weiße Facetten) dellsystem betrifft dies das white-Gen, welches für die rote Augenfarbe wichtig ist. Durch diese Verlagerung kommt es sehr häufig zu einer Stillegung des white-Gens durch Heterochromatisierung. Aufgrund der Struktur des Komplexauges (bestehend aus ca. 800 Einzelaugen/Facetten) bei Drosophila kann in jeder Facette die Aktivität (rot) oder Inaktivität (weiß) des white- Gens erkannt werden. Sichtbar wird dies durch rote bzw. weiße Flecken im Auge. Es handelt sich hierbei um ein System von Gensilencing, das mit der X-Heterochromatisierung beim Menschen vergleichbar ist. Drosophila besitzt viele Vorteile für den Experimentator. Die Entwicklung vom Ei bis zum Imago dauert nur zwölf Tage. Ein Weibchen bringt mehr als 500 Nachkommen hervor. Für genetische Analysen werden oft sehr umfangreiche Nachkommenschaften benötigt; bei bestimmten Experimenten waren mehr als 1 Million Tiere notwendig. Solche Untersuchungen, die zudem noch materiell sehr kostengünstig durchgeführt werden können, sind nur bei Drosophila möglich. Mutanten und Kontrollgene für Gensilencing: Zunächst haben wir Mutationen isoliert, die zu einer Unterdrückung oder Verstärkung von Gensilencing führen. Mutationen der Verpackung der DNA im Chromosom und kontrollieren zugleich den Prozess des Gensilencing. Gensilencing bei Fliege und Mensch erfolgt nach gleichem Mechanismus: Eines der von uns identifizierten Gene haben wir Su(var)3-9 genannt, weil es die veränderliche Ausprägung des white-Gens unterdrückt (Suppressor of variegation), auf dem 3. Chromosom liegt und die Nummer 9 bekommen hat. Inzwischen hat sich herausgestellt, dass der zufällig gewählte Name eigentlich schon die Funktion widerspiegelt. Jahre später wurde gefunden, dass das von diesem Gen gebildete Protein als Histon H3/Lysin9-Methyltransferase funktioniert. Es bindet an Heterochromatin (Abb. 2) und führt hier zur Methylierung der Aminosäure Lysin 9 im Histon H3. Dies bewirkt, dass DNA viel dichter verpackt wird und Gene stillgelegt werden. Die Frage, ob das Su(var)3-9-Gen auch beim Menschen vorkommt, konnte durch einen Vergleich mit der DNA-Sequenz des Menschen beantwortet werden. Die Übereinstimmung in der Aminosäuresequenz zwischen dem Drosophila SU(VAR)3-9- Protein und dem menschlichen SUV39H1- Protein ist mit etwa 70 Prozent sehr hoch. Die Gruppe von Professor Dr. Jenuwein am IMP in Wien, mit der wir eng kooperieren, konnte zeigen, dass auch beim Men-
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