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scientia halensis 4/2002 .................................................................................... Fachbereich Biologie Institut / Projekt Finanzmittel ................................................................................ Eine enorme Bedeutung in diesem Zusammenhang hat die Analyse der Verhaltens- 36 weisen der Module und Systeme, also die Frage, welche Eingaben in das System welche Ausgaben bewirken. Hierauf liegt das eigentliche Hauptaugenmerk der Systembiologie, wobei elementare Prinzipien über die Verschaltung von Elementen und daraus resultierende Verhaltensweisen des Systems aufgedeckt werden sollen, also zum Beispiel die Frage, in welcher Art und Weise einzelne Komponenten verknüpft sein müssen, um ein System hochgradig unanfällig gegen innere und äußere Störungen (robust) zu machen. Der systembiologische Ansatz verfolgt also das Ziel, die aus dem Zusammenspiel einzelner Komponenten resultierenden Eigenschaften zu untersuchen und unterscheidet sich damit vom oben geschilderten Ansatz der Molekularbiologie. Beschreibung eines Systems Institute for Systems Biology, Seattle ERATO-Kitano Systems biology, Tokyo / Pasadena Alliance for Cellular Signaling, USA Systems Biology Research Center, Singapore »Genomes to Life«, DOE, USA »Systeme des Lebens – Systembiologie«, BMBF, Deutschland Im Rahmen einer durch das Land Sachsen- Anhalt geförderten Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Gilles versuchen wir derzeit, das in unserm Labor seit Jahren intensiv untersuchte Lactose-Regulon der Hefe als funktional definiertes System zu beschreiben. Dieses System besteht aus einem regulatorischen und einem metabolischen Netzwerk, die sich gegenseitig beeinflussen. Komponenten des metabolischen Netzwerks sind der Milchzucker Lactose, dessen Spaltprodukte Glucose und Galactose und Enzyme, die Aufnahme und Spaltung der Lactose in der Hefezelle katalysieren. Komponenten des regulatorischen Netzwerks sind Regulatorproteine, welche die Aktivität einer Gruppe von Genen kontrollieren und damit für die Synthese der metabolischen Enzyme verantwortlich sind. Die Aktivierung dieser Gene erlaubt den Hefezellen, die verfügbare Lactose in Energie und Zellmasse umzusetzen. Durch molekularbiologische Struktur-/ Funktionsanalysen konnten wir weitgehend klären, wie die Genaktivität an die Verfügbarkeit von Lactose angepasst wird. Der molekulare Schalter besteht aus drei Proteinen, einem Aktivator (Gal4p), dessen Inhibitor (Gal80p) und dem Induktor (Gal1p), der Lactose-abhängig mit dem Inhibitor interagiert und dessen hemmende Wirkung aufhebt. 200 Mio. US$ 3,2 Mio. US$ / Jahr > 5 Mio. US$ / Jahr 28 Mio. US$ / Jahr 200 Mio. US$ / Jahr (geplant) 45 Mio. US$, fünf Jahre Tab. 1: Finanzmittel der wichtigsten Institute und Projekte im Bereich der Systembiologie Für das Verständnis der Systemeigenschaften des Regulons reicht dieses Detailverständnis jedoch nicht aus. Ob die Lactose- Verwertung aktiviert wird oder nicht, hängt nämlich wesentlich von den Konzentrationsverhältnissen und den absoluten Konzentrationen der Regulatoren ab. Deren Syntheserate wiederum hängt autoregulatorisch von deren Aktivität ab (Abb. 2). Schon kleine Verschiebungen in den Ausgangskonzentrationen können die Syntheserate relativ zueinander verschieben und dadurch die Lactose-Verwertung massiv beeinflussen. Wie sich kleine Veränderungen auswirken, ist jedoch intuitiv schwer vorhersehbar. Erst eine dynamische Betrachtung, die berücksichtigt, dass Inhibitorkonzentration und Inhibitorwirkung umgekehrt proportional zueinander reguliert werden, erfasst den komplexen Zusammenhang. Durch die mathematische Beschreibung des Systemverhaltens erhält man ein Prognosemodell, das letztlich die Genaktivität voraussagen kann und uns in die Lage versetzt, aussagekräftige und in Bezug auf die Modellierung wichtige Experimente zu planen. Wie an diesem Beispiel deutlich wird, wäre es wenig sinnvoll, molekularbiologische und systembiologische Vorgehensweise als Gegensatzpaare zu sehen. Beide Ansätze schließen sich nicht gegenseitig aus, sondern lassen sich sinnvoll verbinden, um zu einem umfassenderen Verständnis biologischer Systeme zu kommen. Abb. 2: Regelkreis der Lactose-Induktion. Der Aktivator Gal4p kann die Gene, die für die Verwertung von Lactose benötigt werden, aktivieren. Ist keine Lactose im Medium vorhanden, bindet der Inhibitor Gal80p an Gal4p und verhindert damit dessen aktivierende Wirkung. In Anwesenheit von Lactose kann Gal1p an Gal80p binden und somit den Aktivator Gal4p von der inhibierenden Wirkung befreien. Der Lactose-Transporter Lac12p transportiert Lactose von außen in die Zelle. Er hat einen Einfluss auf die Menge von Lactose innerhalb der Zelle und somit auch auf den gesamten Induktionsprozess. Alexander Anders hat an der Martin-Luther-Universität Biologie studiert und entwickelt im Rahmen seiner Doktorarbeit am Institut für Genetik ein mathematisches Modell des Hefe-Lactose-Regulons. Karin Breunig wurde an der Universität Heidelberg promoviert (Genetik), habilitierte sich an der Universität Düsseldorf (Mikrobiologie) und ist seit 1996 Professorin am Institut für Genetik der halleschen Universität.
.............................................................................. scientia halensis 4/2002 Fachbereich Biologie WAFFENARSENALE IM MIKROKOSMOS BAKTERIELLE VIRULENZ UND PFLANZLICHE ABWEHR Jens Boch, Thomas Lahaye, Ralf Koebnik und Ulla Bonas Pflanzen produzieren große Mengen an Biomasse, die ein für Mikroorganismen verlockendes Nährstoffreservoir darstellt. Diese Nährstoffe gilt es jedoch raffiniert zu erschließen, denn Pflanzen geben ihren photosynthetisch hergestellten Zucker nicht ohne Gegenwehr heraus. Daher haben es nur speziell angepasste Bakteriengruppen geschafft, sich diesen Lebensraum zu erschließen. Sichtbar wird eine solch gelungene Besiedlung – sehr zum Ärger der Landwirte – durch Krankheitssymptome der Pflanze, die Ernteerträge mindern. In der Abteilung Pflanzengenetik des Instituts für Genetik an der Martin-Luther-Universität wird die Interaktion von bakteriellen Schädlingen und ihren Pflanzenwirten an Modellsystemen untersucht. Xanthomonas campestris pv. vesicatoria ist der Erreger der bakteriellen Fleckenkrankheit bei Tomate und Paprika, Pseudomonas syringae pv. tomato führt zur bakteriellen Fleckenkrankheit auf Tomate und befällt außerdem die in der Molekularbiologie wohlbekannte Modellpflanze Arabidopsis thaliana. Viele molekulare Arbeiten werden erst dadurch ermöglicht, dass das Erbgut von P. syringae pv. tomato, sowie A. thaliana vollständig und das von X. campestris pv. vesicatoria bereits in großen Teilen entschlüsselt wurde. Das essenzielle Waffenarsenal des Schädlings Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Xanthomonas campestris pv. vesicatoria- Zelle (dunkler Bereich) mit Pili, die auf dem Typ-III-Sekretionsapparat sitzen. Foto: AG Bonas ne, sogenannte »Translokatoren« beteiligt. Einen aktuellen Forschungsschwerpunkt stellt in diesem Zusammenhang das molekulare Signal dar, welches die Effektoren aus dem Bakterieninneren durch das Typ- III-System dirigiert. Vergleichende Sequenzanalysen zahlreicher Typ-III-Effektoren deuten darauf hin, dass es eine Präferenz für spezielle Aminosäuren in Effektorproteinen gibt, die möglicherweise für die Sekretion von Bedeutung sind. Die bakterielle Spezialausrüstung – Wirtsspezifität Welche Proteine werden in die Pflanzenzelle injiziert und welchen Nutzen haben diese für die Bakterien? Es wird angenommen, dass die Gesamtheit des Effektor-Arsenals die Virulenz der Bakterien ermöglicht, wobei die Beiträge der einzelnen Effektoren weitgehend ungeklärt sind. Studien haben gezeigt, dass die Deletion einzelner oder mehrerer Effektorgene aus dem Genom der Bakterien keinen oder nur einen geringen negativen Einfluss auf die Fähigkeit von Xanthomonas hat, sich in der Pflanze zu vermehren. Offensichtlich besitzen Pflanzenpathogene eine Vielzahl ............................................................................... Während der Infektion dringen pflanzenpathogene Bakterien in das pflanzliche Gewebe ein und vermehren sich im Raum zwischen den Pflanzenzellen (Interzellularraum). Bei den meisten pflanzenpathogenen Bakterien spielt dabei ein Typ-III-Sekretionssystem (Hrp) eine Schlüsselrolle. Diese molekulare Injektionsspritze ermöglicht die Sekretion von Virulenzproteinen in den Interzellularraum und darüber hinaus eine direkte Injektion sogenannter Effektoren in das Zytoplasma der pflanzlichen Wirtszelle. Interessanterweise finden sich homologe Systeme bei einer Vielzahl von tier- und humanpathogenen Bakterien, so dass man davon ausgehen kann, dass dieser »Injektionsmechanismus« einen Meilenstein in der Evolution pathogener Bakterien darstellt. Pflanzenpathogene haben jedoch eine zusätzliche Hürde zu überwinden, um in Kontakt mit der Wirtszelle zu treten, nämlich die pflanzliche Zellwand. Diese wird vermutlich durch die Ausbildung extrazellulärer fädiger Strukturen am Typ-III-Sekretionsapparat überbrückt, die den Sekretionsapparat wie die Kanüle einer Spritze verlängern. Nach der Passage durch diese Pili gelangen die Effektorproteine in bisher ungeklärter Weise über die Plasmamembran ins Zytoplasma der Wirtszelle. An diesem Vorgang sind wahrscheinlich spezielle bakterielle Proteizum Teil funktionell redundanter Effektoren (ca. 36 in P. syringae pv. tomato), so dass der Verlust Einzelner nicht zum völligen Verlust der Virulenz führt. Für das AvrBs3-Protein, den Prototyp einer Familie von Effektoren, die bisher nur in Xanthomonas und dem nahen verwandten Ralstonia gefunden wurden, konnte gezeigt werden, dass es einen pflanzeneigenen Transportmechanismus nutzt, um nach Injektion ins pflanzliche Zytoplasma in den Zellkern zu gelangen. In AvrBs3 befinden sich neben den hierfür nötigen Kernlokalisierungssequenzen weitere funktionell wichtige Bereiche. Der mittlere Bereich ist durch eine 17-fache fast identische Wiederholung eines Motives aus je 34 Aminosäuren gekennzeichnet, für die angenommen wird, dass sie in der Interaktion mit Wirtsproteinen, oder der direkten Bindung an DNA eine Rolle spielt. Außerdem findet sich eine Domäne, die die Expression von eukaryontischen Genen regulieren könnte. In einem experimentellen Ansatz konnten vor kurzem Paprikagene identifiziert werden, die durch AvrBs3 reguliert werden. Dieses deutet darauf hin, dass pflanzenpathogene Bakterien über Typ-III-Effektoren die Expression von Wirtsgenen zu ihrem Nutzen modulieren. Neben der Genexpression sind auch andere pflanzliche Funktionen Ziele für den Angriff durch Effektoren. AvrPtoB, ein Effektor aus P. syringae pv. tomato, attackiert vermutlich die Abwehrmechanismen der Pflanze. Untersuchungen homologer Faktoren in dem Bohnenpathogen P. syringae pv. phaseolicola konnten zeigen, dass dieser Effektor unter bestimmten Bedingungen die Abwehr der Pflanze unterdrückt. Eine molekulare Erklärung für diesen Effekt könnte darin liegen, dass AvrPtoB in Tomate mit Proteinkinasen in Wechselwirkung tritt, die in der Signaltransduktion von Eukaryonten eine essenzielle Rolle spielen. Die Homologie weiterer Effektoren aus P. syringae pv. tomato mit Tyrosin-Phosphatasen und ADP-Ribosyltransferasen deutet darauf hin, dass Signalwege innerhalb pflanzlicher Zellen ein bedeutendes Ziel für Effektorproteine sind. Überwachungssysteme und Abwehrwaffen einer Pflanze Im Normalfall ist eine Pflanze durch ein umfangreiches Arsenal von Verteidigungssystemen gegen parasitierende Bakterien gefeit. Die Bildung reaktiver Sauerstoff- 37
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