Effekt selektiver und nicht selektiver nichtsteroidaler Antiphlogistika ...

Material und Methoden
2. Waschen
Der verbliebene Überstand wurde verworfen und das gewonnene Pellet mit 500 µl
75%igem Ethanol (SAV-Liquid Production GmbH, Flintsbach) gelöst. Damit sich das
Pellet von der Tubewand löst wurde die Probe vorsichtig gevortext (Vortexer Reax
Top, Heidolph Instruments, Schwabach) und anschließend fünf Minuten bei 4 °C und
7.500 xg zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Der Waschschritt wurde
insgesamt zweimal durchgeführt.
3. Resuspendieren
Der verbliebene Überstand wurde erneut verworfen und das gewonnene Pellet zehn
Minuten bei RT getrocknet. Anschließend wurde es in 30 µl RNase freiem Wasser
(Life Technologies, Invitrogen ® , Darmstadt) durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren
gelöst, bevor es für zehn Minuten bei 58 °C auf einem Heizblock (Thermo-
Inkubationsmischer Thriller ® , Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen) inkubierte.
Danach wurde das Tube für eine Minute auf Eis gestellt und anschließend bei -80 °C
gelagert.
3.4.2.2 RNA Vermessung
Mit einem Spektralphotometer (Smart Spec Plus Spectralphotometer, Bio-Rad
Laboratories GmbH, München) wurde sowohl die Gesamtmenge als auch die
Reinheit der extrahierten RNA bestimmt. Dazu wurde die RNA in einer Konzentration
von 1:50 mit vollentsalztem Wasser (VE-Wasser) verdünnt und die Absorption bei
260 nm sowie 280 nm gemessen. Der aus den beiden Werten berechnete Quotient
gab Aufschluss über die Qualität und Reinheit der RNA und aus der Absorption bei
260 nm wurde die Menge der enthaltenen RNA errechnet (Konzentration [μg/ml] =
OD260 × 40 μg/ml × Verdünnungsfaktor).
3.4.2.3 DNase Verdau
Um eine Verunreinigung der RNA mit DNA zu vermeiden, wurde ein DNase Verdau
durchgeführt. Es wurden 10 µg der extrahierten RNA eingesetzt. Zu dieser wurden
folgende Reagenzien in vorgegebener Reihenfolge pipettiert:
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