Effekt selektiver und nicht selektiver nichtsteroidaler Antiphlogistika ...

Material und Methoden
von Santa Cruz Biotechnology, Inc., Heidelberg. Neben der COX-1 und COX-2
wurde β-Aktin als Primärantikörper eingesetzt. β-Aktin ist ein „Housekeeper“ und
diente als Ladekontrolle, um ein Vorhandensein von Proteinen in der Probe zu
überprüfen.
Zunächst wurden nichtspezifische Bindungsstellen mit 5%iger Magermilch in TBS-T
(COX-1 und β-Aktin) bzw. 2,5%igem BSA in TBS-T (COX-2) blockiert. Dazu wurde
die Membran entsprechend der später zu verwendenden Antikörper zerschnitten und
die einzelnen Abschnitte in Glasküvetten mit Magermilch bzw. BSA für eine Stunde
bei RT auf einem Schüttler (Schüttler VXR basic Vibrax ® , IKA ® -Werke GmbH &
CoKG, Staufen) inkubiert. Danach erfolgte eine dreimalige Waschung für jeweils fünf
Minuten mit TBS-T, um Magermilch- bzw. BSA-Schlieren auf der Membran zu
vermeiden. Anschließend wurden die Primärantikörper (verdünnt in TBS) in einer
Konzentration von 1:200 (COX-1 und 2) bzw. 1:5000 (β-Aktin) auf die Membran
gegeben. Zu den Negativkontrollen wurde statt der COX-1 und COX-2
Primärantikörper nur TBS pipettiert. Alle Glasküvetten wurden mit Parafilm
verschlossen, um ein Verdunsten der Flüssigkeit zu minimieren. Die Inkubation mit
den Primärantikörpern erfolgte über Nacht bei 4 °C unter leichtem Schütteln.
Am nächsten Tag wurden die Proben vier mal fünf Minuten mit TBS-T gewaschen,
bevor der Sekundärantikörper Donkey Anti-Goat (COX-1 und COX-2) bzw. Goat
Anti-Mouse (β-Aktin) beide verdünnt mit TBS und in einer Konzentration von 1:5000,
zu den entsprechenden Membranen gegeben wurden. Die Negativkontrollen
erhielten ebenfalls die entsprechenden Sekundärantikörper. Die Inkubation der
Sekundärantikörper erfolgte für 45 Minuten bei RT. Danach wurden die Membranen
erneut drei mal fünf Minuten in TBS-T und anschließend ein mal fünf Minuten in TBS
gewaschen.
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