Effekt selektiver und nicht selektiver nichtsteroidaler Antiphlogistika ...

Material und Methoden
10 x Inkubationspuffer mit MgCl 2 5 µl
DNase, RNase free (10 U/µl) 1 µl
RNase Inhibitor (40 U/µl) 0,5 µl
RNase freies Wasser ad 50 µl
Anschließend wurden die Proben im Thermocycler (Peqlab Biotechnology GmbH,
Erlangen) nach einem festen Programm behandelt. Zunächst erfolgte eine
20-minütige Inkubation bei 37 °C, die zu einer Aktivierung der DNase führte. Danach
erfolgte eine 10-minütige Inkubation bei 75 °C, die zu einer Deaktivierung und zu
einem Abbau der DNase führte. Anschließend erfolgte eine Lagerung bei 4 °C. Das
Ergebnis des DNase Verdaus waren 10 µg DNA-freie RNA in 50 µl.
3.4.2.4 cDNA-Synthese
Die DNA-freie RNA wurde im Anschluss in cDNA (complementary DNA)
umgeschrieben. Dazu wurden 6 µl DNA-freie RNA eingesetzt. Zu dieser wurden
folgende Reagenzien in vorgegebener Reihenfolge pipettiert:
10 x RT Gold Buffer 5 µl
MgCl 2 (25 mM) 11 µl
dNTP Mix (10 Mm) 10 µl
RandomHexamers (50 µM) 2,5 µl
RNAse Inhibitor (20 U/µl) 1 µl
MultiScribe TM Reverse Transcriptase (50 U/µl) 3,125 µl
Dies wurde mit RNase freiem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 50 µl aufgefüllt.
Die sich anschließende Probenbearbeitung im Thermocycler begann mit einer 10-
minütigen Inkubation bei 25 °C, die der Anlagerung der Primer (RandomHexamers)
an die RNA diente. Es folgte eine 60-minütige Inkubation bei 37 °C, in der die
Transkription stattfand, bevor die Reverse Transkriptase während der sich
anschließenden 5-minütigen Inkubation bei 95 °C abgebaut wurde.
3.4.2.5 Konventionelle PCR für Cyclooxygenase-1 und -2
Bei der RT-PCR wird in vitro ein genau definierter Abschnitt der DNA, bzw. cDNA mit
Hilfe der DNA-Polymerase vervielfältigt. Sie wurde durchgeführt, um die Proben der
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