Effekt selektiver und nicht selektiver nichtsteroidaler Antiphlogistika ...

Material und Methoden
Für die RT-PCR wurde der Deckel des Thermocyclers auf 99 °C erhitzt, um einen
Wasserdampfniederschlag am Deckel zu verhindern. Die Proben wurden in den
bereits erhitzten Cycler gestellt und einem zweiminütigen Denaturierungsschritt bei
95 °C unterzogen. Anschließend erfolgten in Abhängigkeit vom Gen 40 (COX-1) bzw.
35 (COX-2) Zyklen. Ein Zyklus bestand aus drei Abschnitten, die jeweils
30 Sekunden andauerten. Nach der Denaturierung bei 95 °C erfolgte die Anlagerung
des Primers bei 58 °C (COX-2) bzw. 60 °C (COX-1) und anschließend die Elongation
bei 72 °C. Nach Abschluss der Zyklen erfolgte erneut ein Elongationsschritt bei 72 °C
für sieben Minuten. Bei der Negativkontrolle wurde VE-Wasser anstatt der cDNA
eingesetzt.
Im Anschluss erfolgte eine Elektrophorese. Dazu wurden die Proben (12 µl Probe pro
Slot) in ein 2%iges Agarosegel mit Biotium pipettiert, als Laufpuffer diente TBE. Mit
Hilfe des Elektrophoresegerätes (Peqlab Biotechnology GmbH, Erlangen) wurde für
60 Minuten eine Spannung von 100 V angelegt. Anschließend wurden die Banden
mit Hilfe einer Detektionseinheit und der Vision-Capt-Software (Vilber Lourmat,
Frankreich) unter UV-Licht sichtbar gemacht.
3.4.3 Vorbereitung für den Western Blot
3.4.3.1 Proteinisolation
Es wurde die rosa Phase aus der Trizolextraktion verwendet. In dieser befanden sich
die Proteine.
Die Aufreinigung der Proteine umfasste vier Arbeitsschritte:
1. DNA-Präzipitation
Die bei -20 °C aufbewahrte Probe wurde nach dem Auftauen 15 Minuten bei 4 °C
und 12.000 xg zentrifugiert. Dann wurden die Reste der oberen farblosen Phase
(enthielt die RNA) vorsichtig abpipettiert und verworfen. Anschließend wurden 150 µl
100%iger Isopropanol hinzugegeben, das Tube mehrfach geschwenkt und drei
Minuten bei RT inkubiert. Dann erfolgte erneut eine Zentrifugation (5 Minuten, 4 °C,
2000 xg). Nach der Zentrifugation befand sich am Boden des Tubes ein Pellet,
welches die DNA enthielt. Die Proteine waren im Überstand enthalten.
78