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3 Material und Methoden
• 1 Minute Zentrifugation bei 8000 Rpm.
• 1. Waschschritt: Zugabe von 500 µl Puffer AW1 und erneut 1 Minute Zentrifugation
bei 8000 Rpm
• 2. Waschschritt: Zugabe von 500 µl Puffer AW2 und 3 Minuten Zentrifugation bei
14000 Rpm
• Eluierung der doppelsträngigen DNA aus der Säule durch einminütige Zentrifugation
bei 8000 Rpm nach Hinzufügen von 200 µl Puffer AE und einminütiger Inkubation.
Die Extinktion dieses gewonnenen Eluats wurde photometrisch bei 260 nm gemessen
und anhand folgender Formel konnte die DNA-Konzentration bestimmt werden:
DNA − Konzentration = OD 260 × 50 × V erduennung
100
3.8.2 Amplifizierung der DNA - Polymerasekettenreaktion
Die Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaktion, PCR) ist eine in mehreren
Zyklen ablaufende Methode zur exponentiellen Amplifizierung von Nukleinsäure-Fragmenten
um den Faktor bis zu 10 6 . Die Vermehrung der isolierten DNA ist notwendig, weil
der ursprüngliche Gehalt für eine molekularbiologische Diagnostik nicht ausreichend ist.
Dieses Verfahren wurde 1987 von MULLIS und FALOONA veröffentlicht und ist heute
die in klinischen Laboratorien verbreitetste Amplifikationstechnik [97]. Der gesamte Ablauf
beinhaltet einen Denaturierungsschritt, die Anlagerung (Hybridisierung) der Primer
(Annealing) und die Verlängerung des Primers (Extension). Die genaue Methodik war
folgende:
• Jeder Reaktionsansatz enthält (siehe auch Tabelle 3.6 und 3.7) die zu amplifizierende
DNA, Oligonukleotide (Primer), Dinukleotide und thermostabile DNA-Polymerase
(Taq-Polymerase, aus dem thermophilen Mikroorganismus Thermus aquaticus).
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