Einfluss von Mutationen auf die NS2/3-Prozessierung und die ...

ERGEBNISSE
können die in trans bereitgestellten Proteine sowohl das Helfervirusgenom als
auch die DI9 RNA in infektiöse Partikel verpacken.
Das in dieser Arbeit verwendete DI9-Gesamtklonkonstrukt (DI9c) ist im
eigentlichen Sinne eine Kombination aus DI9- und CP7-Sequenzen mit der
Genomorganisation des DI9. In diesem Konstrukt entspricht nur der
Sequenzabschnitt, der die Deletion samt kurzer flankierender Sequenzen
umfasst (Fragment XhoI – HpaI) der originären DI9 Sequenz, während die
übrigen Sequenzanteile dem CP7 entlehnt sind.
Um der Frage nachzugehen, ob ungespaltenes NS2/3 für die BVDV essentiell
ist, wurde aufbauend auf den DI9c-Sequenzen ein Plasmid kreiert, in dem die
Nichtstrukturproteine NS2 und NS3 nicht nur räumlich voneinander getrennt
inseriert sind, sondern auch von verschiedenen internen
Ribosomenbindungsstellen translatiert werden, so dass sie nicht Teile einer
geschlossenen Polypeptidkette sein können. Weiterhin sollte dieses Konstrukt
durch die Auswahl geeigneter Schnittstellen auch die Möglichkeit der Insertion
zusätzlicher interessanter Sequenzen bieten.
Unter Verwendung der Oligonukleotidprimer „BVD2.2“ und „nprobam.rev“ sowie
dem Konstrukt 798 (CP7-Gesamtklon) als Matrize wurde die das N pro
kodierende Sequenz mit Teilen der 5’-NTR mit Hilfe einer PCR isoliert und am
3’-Ende mit einer BamH I-Schnittstelle versehen. Dieses 700 bp große PCR-
Produkt wurde mit den Endonukleasen Xho I und BamH I gespalten und mit
dem „NucleospinExtract-Kit“ aufgereinigt. Weiterhin wurde mit den Primern
„ns3nco.seq“ und „ns3sac.rev“ ausgehend vom Plasmid 798 ein ebenfalls
700 bp großes 5’-terminales Fragment aus dem NS3-Sequenzbereich mittels
einer PCR vermehrt. Das Reaktionsprodukt wurde mit den Enzymen Nco I und
Sac I geschnitten, und ebenfalls mit dem „NucleospinExtract-Kit“ aufgereinigt.
Zur Generierung der für das Konstrukt benötigten zweiten
Ribosomenbindestelle wurde die IRES des EMCV durch eine
Polymerasekettenreaktion mit den Oligonukleotidprimern „citelinker.seq“ und
„pcite.rev“ ausgehend vom Plasmid „pCITE-2a“ amplifiziert. Die Spaltung des
Produktes erfolgte mit den Nukleasen Nco I und BamH I. Anschließend erfolgte
eine Reinigung mit dem „NucleospinExtract-Kit“.
Durch die Ligation der drei Fragmente in das Plasmid „pBlueskript KS - “ wurde
das Konstrukt pRB39 erhalten (Abb.25). Dieses Konstrukt wurde mit den
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