Einfluss von Mutationen auf die NS2/3-Prozessierung und die ...

2.2.6.7 Ligation von DNA-Fragmenten mit T4-DNA-Ligase
MATERIAL UND METHODEN
Die T4-DNA-Ligase katalysiert mit Hilfe von ATP und Mg 2+ -Ionen die
Ausbildung einer kovalenten Phosphodiesterbindung zwischen der 5'-
Phosphatgruppe und der 3'-Hydroxylgruppe von DNA-Molekülen. Für die
Ligation wurden ungefähr 100-500 ng DNA pro Reaktionsansatz (30 µl) in 1 x
Ligationspuffer mit 3 U T4-DNA-Ligase versetzt. Die Ligation erfolgte entweder
für 16 h bei 15 °C oder für 4 h bei RT. Die molaren Verhältnisse der
Ligationspartner (Insert : Plasmid) lagen bei 3 : 1 für die gerichtete Klonierung
(„sticky end“) und bei 5 : 1 für die Ligation glatter Enden („blunt end“).
2.2.6.8 DNA-Agarosegelelektrophorese
Die Agarosegelelektrophorese wurde als Standardmethode zur Analyse und
Reinigung von DNA-Fragmenten eingesetzt.
Für die Auftrennung von DNA-Fragmenten wurden horizontale, 0,6-1,5 %ige
(w/v) Agarosegele verwendet. Die Agarose wurde in 1 x TAE-Puffer (mit
100 ng/ml EtBr) in der Mikrowelle durch Kochen gelöst und in die
Horizontalgelapparaturen gegossen. Nach dem Erstarren wurde das Gel mit
1 x TAE (mit 100 ng/ml EtBr) überschichtet, die DNA-Proben mit 0,1-fachem
Volumen Probenpuffer versetzt und aufgetragen. Die Auftrennung erfolgte bei
4-8 V/cm (i.d.R. 110 V konstant). Als Längenstandard wurde parallel zu den
Proben ein kommerziell erhältlicher Standard aufgetrennt. Nach dem Gellauf
konnten die DNA-Fragmente im UV-Licht (254/302 nm) sichtbar gemacht und
fotografiert werden.
2.2.6.9 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Die Isolierung von DNA aus der Agarose erfolgte mit Hilfe des NucleoTrap Kits
oder des QIAEX-Kits nach Angaben der Hersteller. Das Prinzip beider Kits
beruht auf der Bindung von Nukleinsäuren an Glaspartikel (Vogelstein and
Gillespie 1979). Nach der Restriktionsenzymspaltung wurden die DNA-
Fragmente im Agarosegel aufgetrennt, das gewünschte DNA-Fragment unter
UV-Licht (302 nm) aus dem Gel ausgeschnitten und in ein Eppendorfgefäß
überführt. Nach Auflösung der Agarose in einer Lösung chaotroper Salze und
Zugabe der Glaspartikelsuspension erfolgte die Bindung der DNA an die
Glasmatrix. Nach mehreren Waschschritten wurde die DNA vom Trägermaterial
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