Einfluss von Mutationen auf die NS2/3-Prozessierung und die ...

MATERIAL UND METHODEN
12 h. Nach dem Transfer wurde die „RNA-Leiter“ auf der Membran unter einer
UV-Lampe (254 nm) sichtbar gemacht und mit einem Kugelschreiber markiert.
Zur Zerstörung des Glyoxal, das die folgende Hybridisierung beeinträchtigt, und
zur Fixierung der RNA auf der Membran wurde diese für 3-4 h bei 80 °C im
Vakuum gebacken.
2.2.5.5.2 RNA/DNA-Hybridisierung
Hybridisierungslösung: 5 % Hybridisierungswaschlösung:
36
1,00 mM EDTA 40,00 mM Phosphatpuffer, pH 7,0
0,25 M Na2HPO4 x 2 H2O 1,00 mM EDTA
0,25 M NaH2PO4 x H2O 5,00 % SDS
7,00 % SDS
1 % Hybridisierungswaschlösung:
40,00 mM Phosphatpuffer, pH 7,0
1,00 mM EDTA
1,00 % SDS
Die Hybridisierungen wurden in Glasröhren durchgeführt, die in
Wärmeschränken mit 6 UpM rotierten. Die Hybridisierungstemperatur betrug
54 °C für heterologe Sonden bzw. 68 °C für homologe Sonden. Alle
verwendeten Lösungen wurden im Wasserbad auf 54 bzw. 68 °C vorgewärmt.
Zum Absättigen unspezifischer Bindungsstellen und Auswaschen von
Acridinorange wurde die Nylonmembran mit der gebundenen RNA für 2 x 20
min in ungefähr 20 ml Hybridisierungslösung vorhybridisert. Danach wurde
diese Lösung durch 8 ml frische Hybridisierungslösung ersetzt und die
hitzedenaturierte radioaktive Sonde zugegeben. Die Hybridisierung erfolgte
über Nacht. Am folgenden Tag wurde der Filter einmal 30 min in 5 %iger
Hybridisierungswaschlösung und zweimal je 30 min in 1 %iger
Hybridisierungswaschlösung gewaschen, getrocknet und autoradiographisch
ausgewertet.