Einfluss von Mutationen auf die NS2/3-Prozessierung und die ...

MATERIAL UND METHODEN
wurden in 25% des Ausgangsvolumens eiskalter CaCl2-Lösung resuspendiert
und 40 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurden sie erneut wie oben
beschrieben abzentrifugiert, in 5% des Ausgangsvolumens in eiskalter CaCl2-
Lösung resuspendiert, in 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße aliquotiert und
erneut 1-3 h auf Eis inkubiert. Die nun transformationskompetenten Bakterien
wurden bis zur Verwendung bei –70 °C gelagert.
2.2.3.4 Hitzeschock-Transformation von Plasmid-DNA in Bakterien
Zur Transformation wurden der Ligationsansatz bzw. 10-50 ng Plasmid-DNA zu
50 µl kompetenten E. coli Bakterien-Suspension gegeben und 20 min auf Eis
inkubiert. Nach Durchführung eines Hitze-/Kälteschocks (2 min 42 °C, 1 min auf
Eis) erfolgte die Zugabe von 200 µl LB ++ -Medium. Anschließend wurde der
Ansatz 30-60 min bei 37 °C bebrütet, danach auf einer LB-Agarplatte mit dem
gewünschten Selektions-Antibiotikum ausplattiert und 12-18 h bei 37 °C
inkubiert. Die entstandenen Kolonien wurden zum Animpfen von „Minipreps“
verwendet.
2.2.3.5 Plasmidpräparation für Test-/Kontrollzwecke
Die Isolierung der Plasmid-DNA erfolgte nach dem Prinzip der alkalischen Lyse
(Birnboim and Doly 1979). 1,5 ml einer Übernachtkultur der zu testenden
Bakterienklone wurden 5 min bei 5.000 UpM (Eppendorf-Zentrifuge)
abzentrifugiert. Nach dem Resuspendieren der pelletierten Bakterien im
verbleibenden Restmedium (ca. 50 µl) wurden 300 µl TENS/RNase (0,1 mg/ml
RNaseA) zugegeben und 5 min bei RT inkubiert. Anschließend erfolgten die
Neutralisation mit 150 µl Natriumacetat für 5 min auf Eis und das Pelletieren der
Proteine sowie der chromosomalen DNA (10 min, 14.000 UpM). Der
plasmidhaltige Überstand wurde in ein neues Eppendorfgefäß überführt und die
Plasmid-DNA mit 500 µl Isopropanol gefällt (15 min RT). Die Plasmid-DNA
wurde abzentrifugiert (5 min, 14.000 UpM, Eppendorf-Zentrifuge), einmal mit
500 µl 70 %igem EtOH gewaschen und in der „Speed Vac“ getrocknet. Das
getrocknete Pellet wurde in 50 µl A. dest. aufgenommen und durch Schütteln
gelöst. Für die Spaltung mit Restriktionsendonukleasen wurden 3 µl der DNA-
Lösung in einem 20 µl Ansatz mit der gewünschten Endonuklease für 30-60 min
inkubiert und auf einem Agarosegel aufgetrennt.
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