Einfluss von Mutationen auf die NS2/3-Prozessierung und die ...

ERGEBNISSE
erfolgte mittels Kontrollspaltungen und Sequenzierungen von gereinigter DNA.
Jeweils 4 µg der das veränderte NS2/3 codierenden Plasmide wurden durch
Transfektion in 1 h zuvor mit Vaccinia-MVA/T7 infizierte BHK-Zellen
eingebracht. Die Expression der von den Plasmiden kodierten Sequenzen
erfolgte mittels der RNA-Polymerase des Bakteriophagen T7, die nach
Infektion von Zellen mit dem rekombinanten Vacciniavirus von diesem kodiert
wird (Wyatt, Moss, and Rozenblatt 1995). Damit ist es möglich, definierte
Abschnitte des CSFV-Polyproteins zu exprimieren und deren proteolytische
Prozessierung zu analysieren (Tautz et al. 1996). Für die Darstellung des mit
[ 35 S] Methionin / [ 35 S] Cystein metabolisch markierten NS3 wurden Zelllysate
für eine Radioimmunpräzipitation mit dem Serum anti-A3 eingesetzt. Die
Analyse der präzipitierten Proteine nach Doucet-SDS-PAGE und Fluorographie
ließ aufgrund der Überlagerung der spezifischen Banden mit
Hintergrundsignalen keine Berechnung der Spalteffizienzen der verschiedenen
Mutanten zu. Modifikationen dieses Verfahrens, z. B. durch längere oder
kürzere Inkubationsphasen mit [ 35 S] Methionin- / [ 35 S] Cystein-
Markierungsmedium, brachten keine Verbesserung der Ergebnisse.
3.1.2.3 Einführung von Mutationen in den CSFV-Gesamtklon (p1347)
Die NS2/3 Spalteffizienz und die Auswirkung der Mutationen auf die
Replikationsfähigkeit kann auch auf Basis eines Gesamt cDNA Konstruktes
analysiert werden. Die die Mutationen tragenden Fragmente wurden mit Hilfe
einer Endonukleasespaltung (Bgl II und EcoR I) aus den entsprechenden
Hilfskonstrukten ausgeschnitten und in den mit den gleichen Enzymen
gespaltenen CSFV-Gesamtklon (p1347) eingeführt. Die erfolgreiche Ligation
der veränderten Genabschnitte wurde durch Kontrollspaltung und
Sequenzierungen von gereinigter DNA überprüft.
Gereinigte DNA der die Mutationen tragenden Plasmide wurde zur Erzeugung
eines authentischen CSFV-3'-Endes mit Xma I linearisiert und als DNA-Matrize
für die in vitro Transkription eingesetzt. Nach der Transkription mit Hilfe der
SP6-RNA-Polymerase wurde der Reaktionsansatz durch Gelfiltration mit
Sephadex G-50 gereinigt. Hierdurch wurden freie Nukleotide, die bei der
späteren Transfektion stören würden, entfernt. Anschließend wurde die
transkribierte RNA noch durch Phenol/Chloroformextraktion und Ethanolfällung
gereinigt. Zur Überprüfung der erfolgreichen in vitro Transkription wurden 3 µl
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