Einfluss von Mutationen auf die NS2/3-Prozessierung und die ...

MATERIAL UND METHODEN
präparative Spaltungen mit 1-5 µg DNA. Die Enzyme wurden mit 2-5 U für
30 min bis 4 h eingesetzt.
2.2.6.5 Herstellung glatter Enden an DNA-Molekülen
Für die Ligation nicht kompatibler Enden nach Restriktionsenzymspaltung ist es
z. T. notwendig, an DNA mit Einzelstrang-Überhängen glatte Enden zu
erzeugen. Hierzu wurde das große Fragment der DNA-Polymerase I (Klenow-
Fragment) verwendet, dem die 5'→3'-Exonukleaseaktivität fehlt. Mit Hilfe der
noch vorhandenen 3'→5'-Exonukleaseaktivität und der 5'→3'-Polymerase-
aktivität können durch Abbau eines 3'-Überhanges bzw. durch Auffüllen eines
5'-Überhanges der nicht kompatiblen Enden glatte Enden hergestellt werden.
Zum Auffüllen von 5’-Überhängen wurde die DNA (bis zu 0,25 µg/µl) in 1 x
Klenow-Puffer gelöst und mit 1 Einheit Klenow-Fragment pro µg DNA bei 37 °C
15 min mit dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, je 125 µM) inkubiert. Sollten 3’-
Überhänge entfernt werden, so wurden die dNTPs erst nach 5 min Inkubation
von DNA mit Enzym bei 37 °C zugegeben. Zur Inaktivierung des Enzyms wurde
eine Phenol/Chloroformextraktion mit anschließender Ethanolfällung der DNA
durchgeführt.
Eine alternative Methode stellt die Verwendung von T4-DNA-Polymerase dar.
DNA-Mengen, Nukleotidkonzentrationen und Inkubationszeiten entsprechen
denen der Behandlung mit Klenow-Polymerase, aber mit T4-DNA-Polymerase
kann i. d. R. im Puffer der vorhergehenden DNA-Spaltung gearbeitet werden.
2.2.6.6 Dephosphorylierung von DNA
In linearisierte Plasmide, die kompatible Enden besitzen, lassen sich nur
schwer DNA-Fragmente einsetzen, da der größte Teil der Plasmide religiert.
Um diese Rückligation zu verhindern, werden die 5'-Phosphate der Plasmid-
DNA durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase (CIP oder SAP)
abgespalten. Zur Dephosphorylierung wurden 1-2 µg linearisierte DNA mit
1-2 Einheiten alkalischer Phosphatase in 1 x AP-Puffer versetzt und in 50 µl
Volumen für 30 min bei 37 °C inkubiert. Dieser Schritt kann auch bereits parallel
zur Spaltung durchgeführt werden. Danach wurden eine
Phenol/Chloroformextraktion mit anschließender Ethanolfällung (CIP) oder nur
eine Hitzeinaktivierung (SAP) durchgeführt.
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