Einfluss von Mutationen auf die NS2/3-Prozessierung und die ...

ERGEBNISSE
Die Auswertung am Phosphor-Imager erbrachte für die verschiedenen CSFV-
Stämme unterschiedliche Spalteffizienzen (Abb. 4).
Beim Vergleich der für die CSFV-Stämme ermittelten Werte mit für Mutanten
des BVDV Stammes Oregon erhaltenen Daten lässt sich erkennen, dass nicht
ausschließlich die Menge an exprimiertem NS3 maßgeblich für die Ausbildung
des zp Phänotyps sein kann. Oregon Mutanten mit einer Spalteffizienz von rund
60% und darüber zeigten in infizierten Zellen einen ZPE (Kümmerer and
Meyers 2000). Der CSFV-Stamm Brescia zeigt eine Prozessierungseffizienz
von fast 67 %, ist aber eindeutig nicht zytopathogen. Ferner muss festgehalten
werden, dass Oregon-Mutanten mit NS2/3-Spalteffizienzen von weniger als
55 % nicht lebensfähig sind, während Viren der klassischen Schweinepest mit
vergleichbaren oder sogar geringeren Spalteffizienzen replizieren und keine
Wachstumsdefizite aufweisen. Damit kann darauf geschlossen werden, dass
andere Unterschiede zwischen BVDV und CSFV bzw. den verwendeten Zellen
(mit)entscheidend für den Phänotyp sind.
3.1.2. Einführung von Mutationen an der NS2/3-Spaltstelle
3.1.2.1 Gerichtete Mutagenese
Die NS2/3-Spaltstelle wurde für CSFV noch nicht bestimmt. Für andere
Pestiviren, insbesondere BVDV, konnte diese Prozessierungsstelle jedoch
identifiziert werden. Die fragliche Region, besonders der Aminoterminus des
NS3, ist bei BVDV hoch konserviert. Durch Sequenzvergleiche konnte aufgrund
hoher Homologie für Viren der klassischen Schweinepest ein entsprechender
Bereich identifiziert werden, der die vermutliche NS2/3-Spaltstelle enthält. Zur
Überprüfung, wie sich eine veränderte Spaltstelle auf die Spalteffizienz, den
Phänotyp und die Lebensfähigkeit der Viren auswirkt, wurden verschiedene
Punktmutationen im Bereich der Spaltstelle NS2/3 des Stammes Alfort
eingeführt. Für die Untersuchung der Prozessierung des Nichtstrukturproteins
NS2/3 des Stammes Alfort wurde, ausgehend vom vorhandenen cDNA-Klon
p1347, der Sequenzabschnitt NT 3945-5560 in den Expressionsvektor pCITE-
2a kloniert (Konstrukt pRB03). Die Mutagenesen wurden mittels eines PCR-
Verfahrens durchgeführt, bei dem die gewünschte Mutation über
komplementäre, die Mutation tragende Primer eingeführt wird. Im Anschluss an
diese Reaktion erfolgt die Zugabe von Dpn I, das nur methylierte DNA
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