Einfluss von Mutationen auf die NS2/3-Prozessierung und die ...

ERGEBNISSE
Abb. 23: Interne Kontrolle der quantitativ-kompetitiven PCR mittels GAPDH-PCR.
E, F, G und H zeigen die Agarosegelbilder der internen Kontrolle der quantitativ-kompetitiven
PCR mittels GAPDH-PCR unter Verwendung spezifischer Oligonukleotid-Primer für die
GAPDH-mRNA. Als Template dienten je Ansatz jeweils 2 µl des in der RT generierten
Templates für die quantitativ-kompetitive PCR.
E: WT-CP7, F: NCP7, G: Mut-NS4B-CP7, H: Mut-NS4B-NCP7
Spur –2: Wasserkontrolle, Spur –1: nicht infizierte KOP-R-Zellen, Spur 1: Größenmarker,
Spuren 2 – 7: Proben entsprechend der in der quantitativ-kompetitiven PCR bei A – D
eingesetzten Templates.
Die Auswertung der quantitativ-kompetitiven PCR erfolgte mit Hilfe des
Programms Tina 2.0. Hierzu wurden die Bilder der Agarosegele in den Rechner
eingelesen und die relative Intensität der Banden ermittelt. Das molare
Verhältnis zwischen der viralen cDNA und dem PCR-Produkt des Konstrukts
(pRB56) wurde unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Sequenzlänge
von viraler cDNA und Konstrukt wie folgt berechnet:
(Signalintensität der viralen cDNA / Signalintensität des Standard-PCR-
Produkts) x (Größe viraler cDNA [in bp (283)] / Größe des Standards
[in bp (247)])
Zur Ermittlung des Äquivalenzpunktes wurde der log10 Wert der molaren Ratio
gegen den log10 Wert der Konzentration (ng/µl) des als internen Standard
eingesetzten Fragments jeder Reaktion abgetragen. Der Schnittpunkt des
Graphen mit der x-Achse stellt den Äquivalenzpunkt für die entsprechende
Probe dar.
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