Einfluss von Mutationen auf die NS2/3-Prozessierung und die ...

ERGEBNISSE
5 %iger Formalinlösung fixiert und anschließend mit 1 %iger Kristallviolett-
lösung überschichtet. Man erkennt den intakten Zellrasen in allen mit den
NS4B-Mutanten sowie in den mit den nzp-WT-Viren infizierten Kavernen. Ein
ZPE und die damit verbundene Lyse der Zellen ist ausschließlich in den mit
dem CP7-WT infizierten Zellen in der Vertiefung sechs zu erkennen. Hier
konnten keine zellulären Proteine mehr mit dem Farbstoff Kristallviolett gefärbt
werden (Abb. 15). Damit war gezeigt, dass diese Mutation nicht nur den BVDV
Stamm NADL, sondern auch andere zp Biotypen in nzp Viren wandelt.
Interessanterweise zeigte sich auch zwischen CSFV Alfort/Tübingen und seiner
Mutante ein Unterschied. Während die mit diesem WT infizierten Zellen in der
Kristallviolettfärbung eine leicht gebrochenen Färbung zeigten, war die Kaverne
mit der CSFV-NS4B-Mutante gleichmäßig angefärbt. Dies deutet darauf hin,
dass CSFV Alfort/Tübingen doch eine gewisse Zellschädigung herforruft, die
nach der Mutation des Tyrosins ausbleibt.
Die Lebensfähigkeit und Stabilität der Mutanten im Vergleich mit den jeweiligen
Wildtypen wurde über fünf Passagen verfolgt. Molekularbiologische
Untersuchungen, wie die Sequenzierung der RT-PCR-Produkte, zeigten, dass
nach derartiger Vermehrung der Mutanten keine Reversion über den
genannten Zeitraum auftrat. Zur Abklärung, ob die jeweiligen im NS4B
veränderten Viren Wachstumsnachteile gegenüber den Wildtypviren
aufwiesen, wurden vergleichende Wachstumskurven ermittelt und verglichen.
Hierzu wurden entsprechende Zellen mit den zu testenden Viren mit einer m.o.i
von 0,01 infiziert und für verschiedene Zeiträume, von 12 bis 124 h, inkubiert.
Das jeweilige Wildtypvirus diente als Kontrolle. Diese Ansätze wurden nach der
entsprechenden Zeit bis zur Titration bei –72 °C gelagert. Die Untersuchung
erfolgte in Triplikaten. Anhand der Wachstumskurven lässt sich erkennen, dass
die Viren mit der Veränderung im NS4B gegenüber ihren WT-Vergleichsviren
keine signifikanten Wachstumsvor- oder Nachteile haben.
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