Einfluss von Mutationen auf die NS2/3-Prozessierung und die ...

ERGEBNISSE
Im Gegensatz zu allen anderen untersuchten Mutanten konnten für DI9c nach
Transfektion keine positiven Zellen detektiert werden. Ein infektiöses Virus aus
dem veränderten DI9c-Konstrukt scheint somit nicht lebensfähig zu sein. In den
zell- und molekularbiologischen Untersuchungen konnte in diesem Fall nur das
nzp Virus, mit dem die Zellen zuvor infiziert wurden, nachgewiesen werden.
Zur weiteren Überprüfung wurden nicht infizierte MDBK-Zellen durch
Elektroporation mit in vitro transkribierter RNA von DI9c bzw. Mut-NS4B-DI9c
transfiziert. Diese Methode erreicht wesentlich höhere Transfektionseffizienzen
und ermöglicht somit den Nachweis von RNA-Replikation unabhängig von
Neuinfektion von Zellen. In Zellen, die mit RNA des DI9c transfiziert wurden,
konnte in der indirekten Immunfluoreszenz mit dem monoklonalen Antikörper
„Code 4“ das Nichtstrukturprotein NS3 nachgewiesen werden. Dieser Befund
dient als Nachweis der selbständigen Replikation des DI9c. Dagegen war im
Falle von mit der Mutante Mut-NS4B-DI9c transfizierten MDBK-Zellen die
autonome Replikation nicht nachweisbar. Damit bestätigte sich der Verdacht,
dass die DI9c-Mutante nicht lebensfähig war.
Um zu zeigen, dass in den anderen Ansätzen tatsächlich genetisch veränderte
Viren erzeugt worden waren, sollte die Sequenzveränderung im Genom der
rekombinanten Viren nachgewiesen werden. Dazu wurden Zellen mit den
erhaltenen Viren infiziert. Nach 24 h erfolgte die Isolierung von Gesamtzell-
RNA. Ausgehend von dieser isolierten RNA wurde eine RT-PCR mit
geeigneten Oligonukleotiden (CSFV: „hcv57-1.seq“ und „csfv7617.rev“; CP7,
NCP7: „B35-2.seq“ und „BVDV-O.rev“; DI9c: „panpesti.seq“ und „bvdv-O.rev“;
NewYork: „cm38.seq“ und „cm57.rev“; Oregon: „N-NS4A.seq“ und „C-
NS4B.rev“) durchgeführt. Als Vergleich diente RNA aus mit den jeweiligen
Wildtypen transfizierten Zellen. Nach Auftrennung der RT-PCR-Produkte im
Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegel konnten die DNA-Fragmente
nachgewiesen werden. Eine PCR-Kontrolle, die ohne Zugabe von viraler RNA
durchgeführt wurde, lieferte kein Amplifikationsprodukt. Die jeweiligen Reste
der PCR-Produkte wurden mit dem „NucleospinExtract-Kit“ aufgereinigt und in
50 µl A. dest. eluiert. Jeweils 2 µl der Eluate wurden zur Sequenzierung
eingesetzt.
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