Einfluss von Mutationen auf die NS2/3-Prozessierung und die ...

ERGEBNISSE
bei der RNA-Transfektion stören würden. Anschließend wurde die transkribierte
RNA noch durch Phenol/Chloroformextraktion und Ethanolfällung gereinigt. Zur
Überprüfung der erfolgreichen in vitro Transkription wurden 3 µl des
Transkriptionsansatzes im denaturierenden Agarosegel aufgetrennt. Im
Folgenden wurde untersucht, ob die Transfektion von geeigneten Zielzellen mit
in vitro transkribierter RNA zur Bildung von infektiösen Viren führt. Hierzu
wurden 5 µl des Transkriptionsansatzes für die Transfektion von SK6- (CSFV)
bzw. MDBK-Zellen (BVDV) eingesetzt.
Im Falle des DI9 wurden die zu transfizierenden MDBK-Zellen am Tag zuvor
mit dem NCP7-Wildtyp-Virus mit einer m.o.i. von 1 infiziert. Das NCP7 diente in
diesem Fall als Helfervirus, das in trans die Strukturproteine sowie p7 und NS2
bereitstellt und so für die Verpackung der Erbinformation des DI9 in infektiöse
Partikel sorgt.
Die Transfektion erfolgte wie zuvor beschrieben nach der DEAE-Dextran-
Methode. 72 h nach der Transfektion wurden die Zellen durch Behandlung mit
Trypsin aus der Kulturschale abgelöst und im geeigneten Verhältnis weiter
passagiert. Eine erneute Passage erfolgte weitere drei Tage später. Als
Kontrolle diente RNA der Wildtypen der verwendeten Pestiviren, die in vitro
transkribiert wurde.
72 h nach der Transfektion wurden die Zellen umgesetzt. Nach weiteren 24 h
sowie nach fünfmaliger Passage wurde untersucht, ob virusspezifische
Proteine in der Zelle gebildet worden waren. Es konnte eine diffuse Verteilung
von zerstörten bzw. abgekugelten Zellen im Zellrasen der mit dem CP7-WT-
Virus infizierten Zellen beobachtet werden, was als Hinweis auf die Replikation
des zp Virus gelten konnte. Bei keinem der anderen Ansätze war die
Ausbildung eines ZPE zu sehen. Nach der Fixierung des Zellrasens mit
Methanol / Aceton (1:1) bei -20 °C wurden die infizierten Zellen mit
spezifischen monoklonalen Antikörpern inkubiert (CP7, NCP7 und deren
Mutanten mit dem mAk-Mix: „BVD-Mix“ und CSFV und Mutante mit „α-A18“).
Nach der Inkubation dieses 1. Ak für 1 h bei 37 °C erfolgte die Behandlung mit
dem FITC markierten 2. Antikörper, ebenfalls für 1 h bei 37 °C. Ein intakter
Zellrasen war in allen mit den NS4B-Mutanten sowie in den mit den nzp-WT-
Viren infizierten Kavernen zu erkennen (Abb. 14).
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