Einfluss von Mutationen auf die NS2/3-Prozessierung und die ...

DISKUSSION
und Alanin haben deutlich unterschiedliche chemische Eigenschaften. Viren mit
den Substituenten Prolin und Asparaginsäure an P1’ des CSFV-Proteins waren
nicht lebensfähig. Offenbar verändern diese Substitutionen die Struktur der
Spaltstelle dermaßen, dass entweder die Spaltung nicht mehr in
ausreichendem Maße möglich ist, oder die Funktion des NS3-Proteins
eingeschränkt wird. Hierfür spricht zum einen, dass bei der Substitution durch
Prolin nur Revertanten auftraten, während beim Substituenten Asparaginsäure
keine lebensfähigen Viren detektiert werden konnten. Ferner könnte auch ein
Einfluss auf die Struktur des NS2/3-Proteins denkbar sein. So ist Prolin durch
seine Ringstruktur häufig in Knicken gefalteter Proteinketten zu finden.
Alle weiteren überprüften Veränderungen des Spaltstellenbereichs waren
entweder letal oder nicht stabil. Bei den neun nachgewiesenen Revertanten
scheint der Eingriff in die Proteinstruktur dermaßen umfangreich zu sein, dass
eine uneingeschränkte Replikation nicht möglich und somit eine „Reparatur“
notwendig ist. Das Zurücksetzen in den ursprünglichen Zustand macht deutlich,
wie empfindlich das System „Virus“ auf die Veränderungen an der Spaltstelle
„reagiert“. Leider gelang es im Rahmen dieser Arbeit nicht, für alle Mutanten die
NS2/3-Spalteffizienz zu bestimmen. Es fällt jedoch auf, dass die stabilen
Mutanten R-P1-H, G-P1’-A und G-P1’-S Wildtyp-Spalteffizienzen zeigten. Es ist
damit gut vorstellbar, dass die Mutanten, die revertieren oder gar nicht
lebensfähig sind, deutlich veränderte Spalteffizienzen zeigen und dies die
Ursache für Reversion oder Nicht-Lebensfähigkeit ist.
Neben der Mutante M44 (G-P1’-D) konnten drei weitere untersuchte Mutanten
(M59, M60 und M61) in der Zellkultur weder mittels RT-PCR noch IF
nachgewiesen werden. Die eingeführten Veränderungen scheinen demnach die
Funktion der kodierten Proteine dermaßen zu stören, dass selbst die wenigen
Replikationszyklen, die zur Reversion notwendig wären, nicht möglich sind.
Im Gegensatz zu den Versuchen mit CSFV wurde bei den Spaltstellenmutanten
desBVDV Oregon keine einzige Variante gefunden, die nicht revertierte.
Mutanten wie M45 oder M57, die wildtypähnliche Prozessierung zeigten,
konnten zwar als infektiöse Gesamt-cDNA-Klone erhalten werden, revertierten
jedoch innerhalb weniger Passagen. Ein direkter Vergleich der Systeme CSFV
und BVDV Oregon ist nur im Fall der Mutante M45 möglich. Während im CSFV-
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