Einfluss von Mutationen auf die NS2/3-Prozessierung und die ...

ERGEBNISSE
die Viren so stark schädigen, dass eine Reparatur durch Reversion oder
Pseudoreversion nicht möglich ist. Dies deutet darauf hin, dass die Mutanten
nicht fähig sind, in nennenswertem Maße RNA zu replizieren.
Es bleibt festzuhalten, dass eine Änderung des Phänotyps zum nzp Virus durch
Reduktion der Spalteffizienz offensichtlich nicht auftritt. Bei den Mutanten M45,
M56, M57 und M 58 trat der ZPE verglichen mit dem Wildtyp in der ersten
Passage nach der Transfektion um einen Tag verzögert auf. In den folgenden
Zyklen konnte optisch keine Divergenz mehr festgestellt werden. Zu gleichen
Zeitpunkten post transfectionem wurde auch RNA geerntet. Die Sequenzierung
der über eine RT-PCR erhaltenen cDNA bestätigte den Verdacht, dass jedes
der überprüften mutierten Viren revertiert hatte. Alle überprüften Revertanten
wiesen wieder die Wildtypsequenz auf. BVD-Viren vom Stamm Oregon
scheinen mit veränderten Aminosäuresequenzen an der NS2/3-Spaltstelle nicht
lebensfähig zu sein. Für CSFV Alfort konnten dagegen wie oben beschrieben
drei stabile Mutanten nachgewiesen werden, von denen zwei den
Aminoterminus des NS3 betrafen.
Abb. 12: Oregon-NS2/3-Mutanten
Um die Lebensfähigkeit der potentiellen NS2/3-Mutanten zu untersuchen, wurden MDBK-
Zellen mit einer m.o.i. von 1 infiziert und die Entwicklung beobachtet. Nach der Fixierung des
Zellrasens mit Methanol / Aceton (1:1) bei -20 °C wurden die infizierten Zellen mit einem
spezifischen monoklonalen Antikörpermix inkubiert („BVD-Mix“).Nach der Inkubation mit dem
1. Ak für 1 h bei 37 °C erfolgte die Behandlung mit dem FITC-markierten 2. Antikörper,
ebenfalls für 1 h bei 37 °C. Man erkennt den ZPE im Zellrasen in allen mit den potentiellen
NS2/3-Mutanten infizierten Kavernen.
1: MDBK-Zellen mit Oregon-WT, 2: MDBK-Zellen mit Oregon-Mut 45,
3: MDBK-Zellen mit Oregon Mut 56, 4: MDBK-Zellen mit Oregon-Mut 57,
5: MDBK-Zellen mit Oregon-Mut 58
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