Einfluss von Mutationen auf die NS2/3-Prozessierung und die ...

2.2.6 Standard DNA-Techniken
2.2.6.1 Phenol/Chloroform-Extraktion von Nukleinsäuren
MATERIAL UND METHODEN
Um Proteine aus wässrigen Nukleinsäurelösungen zu entfernen, wurden diese
mit einem Volumen Phenol ausgeschüttelt (Sambrook, Fritsch, and Maniatis
1989). Die Proteine gelangen dabei in die Phenol- oder Interphase. Durch
Zentrifugation bei 14.000 UpM (Eppendorf-Zentrifuge) für 4 min erfolgte die
Phasentrennung. Nach Abnahme der oberen, nukleinsäurehaltigen wässrigen
Phase und Überführung in ein frisches Gefäß wurde in gleicher Weise noch
zweimal extrahiert: einmal mit 1:1 Phenol/Chloroform und abschließend nur mit
Chloroform. Durch eine anschließende Ethanolfällung wurde die Nukleinsäure
weiter gereinigt und konzentriert.
2.2.6.2 Ethanolfällung von DNA
Die DNA-Lösung wurde mit 1/10 Volumen einer 3 M NaAc (pH 5,4) und dem
2,5fachen Volumen absolutem EtOH vermischt und für 30 min bei –70 °C oder
auf Trockeneis inkubiert. Anschließend wurde die DNA 15 min mit 14.000 UpM
bei 4 °C (Eppendorf-Zentrifuge) pelletiert. Zum Entfernen vorhandener
Salzreste wurde die DNA mit 70 %igem EtOH gewaschen, danach im Vakuum
bei Raumtemperatur getrocknet und in A. dest. gelöst.
2.2.6.3 Isopropanolfällung von DNA
Die DNA-Lösung wurde mit 1/10 Volumen 3 M NaAc (pH 5,4) und dem 0,7-
fachen Volumen Isopropanol vermischt und für 5 min bei RT inkubiert. Das
Pelletieren und Waschen der gefällten DNA erfolgten wie bei der EtOH-Fällung.
2.2.6.4 Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen
Zur Analyse und Klonierung von Plasmid-DNA wurde diese mit
Restriktionsendonukleasen des Typs II behandelt, die spezifische Sequenzen in
doppelsträngiger DNA erkennen und spalten können. Die Spaltung von DNA
erfolgte nach den Vorschriften der Lieferanten der entsprechenden Enzyme
unter Verwendung der mitgelieferten Puffer. Dabei wurden DNA-
Konzentrationen von 0,3 µg/ml nicht überschritten. Die Volumina betrugen
10-20 µl für analytische Spaltungen mit bis zu 0,3 µg DNA und 50 µl für
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