Einfluss von Mutationen auf die NS2/3-Prozessierung und die ...

MATERIAL UND METHODEN
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit” (Applied Biosystems)
durchgeführt.
Reaktionsansatz: 1,0 µg zu sequenzierende DNA
3,6 pM Oligonukleotid-Primer
3,0 µl Reaktionsmix BigDye-Kit
ad 10,0 µl Aqua bidest.
Die Sequenzreaktionen wurden im 9600-PCR System von Perkin-Elmer
durchgeführt.
Reaktionsbedingungen: 24 Zyklen mit je:
30 sec 96 °C, 15 sec 50 °C, 4 min 60 °C
Kühl- und Lagerschritt auf 4 °C
Der Reaktionsansatz wurde anschließend mit 56 µl Ethanol (100%) und 26 µl
A. dest. gemischt, 5 Minuten bei RT gefällt, 60 Minuten mit 14.000 UpM
zentrifugiert (Eppendorfzentrifuge), mit 100 µl Ethanol (75%) gewaschen und
getrocknet. Dieses getrocknete Pellet wurde bis zur Analyse auf einem
Sequenzgel bei –20 °C gelagert. Zur elektrophoretischen Auftrennung der
sequenzierten Reaktionsprodukte wurde die Probe in 3,5 µl Probenpuffer für
DNA-Sequenzgele resuspendiert und drei Minuten bei 95 °C denaturiert. Von
diesem Ansatz wurden 1,7 µl auf das Gel aufgetragen.
2.2.8.2 Elektrophorese von Sequenzreaktionen im Harnstoff-Acrylamid-Gel
Die Sequenzreaktionen der DNA-Proben wurden durch Elektrophorese in 7 M
Harnstoff-5,25%-Acrylamid-Gelen (Long Ranger) in 1x TBE im ABI PRISM 377
DNA Sequencer mit einer Trennstrecke von 48 cm analysiert. Das System
wurde nach Angaben des Herstellers installiert.
Die Gel-Mischung wurde durch Nitrocellulose mit 0,2 µm Porendurchmesser
und Anlegen eines Vakuums filtriert und entgast. Nach Zugabe von 300 µl APS
(10%) und 42 µl TEMED wurde das Sequenzgel zwischen die montierten
Glasplatten gegossen. Nach Auspolymerisieren des Gels erfolgte der Einbau in
die Apparatur mit 1 x TBE als Elektrophorese-Puffer.
Sobald beim Vorlauf (1.000 V, 50 W, 35 mA) eine Betriebstemperatur von 51 °C
erreicht war, wurden die Proben aufgetragen und der Hauptlauf gestartet
44