Einfluss von Mutationen auf die NS2/3-Prozessierung und die ...

ERGEBNISSE
eine RT-Reaktion eingesetzt, die neben dem Primer „Panpesti.rev“ auch ein
Oligonukleotid für das „housekeeping“-Enzym Glycerinaldehyd-3-phosphat
Dehydrogenase (GAPDH) enthielt. Dieses Enzym der Phosphatketten-
Phosphorylierung der Glykolyse wird in allen Zellen konstitutiv exprimiert und
somit ist die mRNA immer in vergleichbaren Mengen in den Zellen vorhanden.
Daher eignet sich der Nachweis dieser RNA gut als interne Kontrolle.
Im Anschluss an die RT-Reaktion wurden jeweils 2 µl dieses Ansatzes in die
Polymerase Kettenreaktion eingesetzt.
Anschließend wurde eine Verdünnungsreihe in 10fachen Abstufungen
ausgehend von 10 ng bis zu einer Konzentration von 100 fg angelegt. Für den
Quantifizierungsansatz wurden in der PCR jeweils 2 µl des RT-Ansatzes und
1 µl des auf eine genaue Konzentration eingestellten internen Standards aus
3.3.6.1, als Kompetitor, eingesetzt. Ziel dieser Reaktion war es, den
Äquivalenzpunkt, also diejenige Konzentration des Kompetitors zu ermitteln, bei
der sich im abschließenden Agarosegel zwei gleich stark ausgeprägte Banden
detektieren lassen. Da beide Fragmente gleiche Primerbindungsstellen und
eine vergleichbare Größe besitzen, ist die Menge des in der PCR gebildeten
Amplifikats primär nur von den eingesetzten Mengen der Matrizen abhängig. In
Abb. 22 ist die untere Bande vom eingesetzten PCR-Fragment bestimmter
Konzentration abgeleitet und die obere Bande wird ausgehend vom
Genfragment aus der RT-Reaktion amplifiziert. Bei einem ungleichen
Verhältnis, also einem Überschuss eines der in der Reaktion eingesetzten
Templates, verschiebt sich die Bandenstärke zugunsten des überwiegenden
Konkurrenten. Dieses Verfahren ist auf alle Pestiviren übertragbar, da die
verwendeten Panpesti-Primer mit den Genomen aller zu diesem Genus
gehörenden Viren hybridisieren.
Man erkennt in Abb. 22, dass die eingesetzten viralen RNAs zu deutlich
unterschiedlichen Äquivalenzpunkten in der Analyse führen. Beim CP7-Wildtyp
liegt das Gleichgewicht der Reaktionspartner, wie in Spur A5 zu erkennen ist,
bei ca. 10 pg Kompetitor im Reaktionsansatz. Bei der entsprechenden NS4B-
Mutante ist der Äquivalenzpunkt bei ca. 50 pg erreicht, also etwa im Bereich der
Spuren C4 / C5. Beim Vergleich der Wildtyp-Viren mit den entsprechenden
Mutanten wird eine Verschiebung des Äquivalenzpunktes erkennbar. Damit
produziert das nichtzytopathogene Mut-NS4B-CP7-Virus um den Faktor fünf
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