Einfluss von Mutationen auf die NS2/3-Prozessierung und die ...

MATERIAL UND METHODEN
Komplexe von ungebundenem Protein und freien, markierten Aminosäuren
getrennt. Dazu wurden die Präzipitate resuspendiert, mit 500 µl Sucrose-
Lösung unterschichtet und pelletiert (25% Sucrose, 5 min, 4.500 UpM,
Tischzentrifuge). Die Überstände wurden abgesaugt und die Proben in 1 ml
1 %igem Triton-Puffer (neu) resuspendiert und bei 4.000 UpM (Eppendorf-
Zentrifuge) für 4 min zentrifugiert. Nach erneutem Waschen der sedimentierten
Komplexe mit 0,2 %igem Triton-Puffer wurden die Pellets in 10 µl einer
Mischung aus 3 ml 0,2 %igem Triton und 7 ml A. dest. aufgenommen. Nach
Zugabe von 40 µl Probenpuffer mit 5% ß-Mercaptoethanol wurden die Proben
für 3 min auf 95 °C erhitzt und 10 min bei 10.000 UpM (Eppendorf-Zentrifuge)
zentrifugiert. Der Überstand mit den freigesetzten Proteinen wurde in ein neues
Eppendorfgefäß überführt und die Radioaktivität von 5 µl-Aliquots mit einem
Szintillationszähler bestimmt. Entsprechend der Radioaktivitätsmenge wurde
die Menge des Probenmaterials ermittelt, die dann in einer SDS-PAGE
aufgetrennt wurde.
2.2.11.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
Die SDS-PAGE wurde nach der Anleitung von (Schägger and von Jagow 1987)
bzw. (Doucet and Trifaro 1988) durchgeführt. Während die „Jagow-Gele“
vorwiegend für die Auftrennung von Proteinen mit niedrigen
Molekulargewichten verwendet wurden, erfolgte die Analyse von NS2/3 und
NS3 in „12 %igen-Doucet-Gelen“.
Lösungen für „Jagow-Gele“:
Acrylamidlösung 30:1: 40,00 % Acrylamid (w/v),
1,33 % N,N’-Methylenbisacrylamid (w/v)
in A. dest.
Gelpuffer: 3,0 M Tris-HCl, pH 8,45
0,3 % SDS
in A. dest.
(im Trenngel 1:3, im Sammelgel 1:4 verdünnt)
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