Einfluss von Mutationen auf die NS2/3-Prozessierung und die ...

MATERIAL UND METHODEN
ausgezählt. Die Berechnung der Zellzahl (in Zellen/ml) erfolgte mittels folgender
Formel:
gezählte Zellen x 4 x Verdünnungsfaktor x 0,35 x 10 3 .
2.2.1.3 Titration und Titerberechnung
Die Endpunkttitrationen von Viren erfolgten in 96-well-Platten. Je Titrationsreihe
wurde mit 100 µl des Virusstocks begonnen. Die Virusverdünnung wurde in
5 ml-Glasröhrchen in Doppelbestimmungen durchgeführt und erfolgte in
Verdünnungsstufen von 1:10. Jeweils 100 µl Virusverdünnung wurden in vier
entsprechende Kavernen einer 96-well-Platte überführt. Anschließend wurden
1,75 x 10 4 MDBK- oder SK6-Zellen (BVDV bzw. CSFV) in 100 µl FCS-haltigem
Medium den Titrationsreihen zugegeben und der Ansatz für drei bis fünf Tage
im Brutschrank inkubiert. Die Auswertung der Titration erfolgte bei zp Viren über
die Identifikation des ZPE in der entsprechenden Kammer. Der Fortschritt des
ZPE wurde täglich verfolgt. Der Titer, bezogen auf einen Milliliter, wurde
rechnerisch nach Spearman und Kärber wie folgt ermittelt:
Negativer Log. des 50%-Endpunktes = Negativer Log. der höchsten
verwendeten Viruskonzentration - [ (((Summe der % der inf. Kulturen jeder
Verdünnung / 100) - 0.5) x Log. der Verdünnung) ]
Da die Infektion bei der Messung mit 100 µl Verdünnung erfolgte, musste für die
Umrechnung auf ml noch der Wert 1 von dem Ergebnis subtrahiert werden.
Wenn durch die Messung ein Wert von 10 -4,75 ermittelt wurde, bedeutete dies,
dass 1 ml des Überstandes in einer Verdünnung von 10 -4,75 alle Zellen einer
Kultur mit einer Wahrscheinlichkeit von 50% infizierte. Der Titer dieses
Überstandes wurde dann mit TCID50 von 10 4,75 angegeben. Dabei wurde für
jeden Virusstock der Mittelwert aus beiden Titrationsreihen ermittelt.
Die Auswertung der Titration von nzp Viren erfolgte mittels der indirekten
Immunfluoreszenz.
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