Einfluss von Mutationen auf die NS2/3-Prozessierung und die ...

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ERGEBNISSE 5 %iger Formalinlösung fixiert und anschließend mit 1 %iger Kristallviolett- lösung überschichtet. Man erkennt den intakten Zellrasen in allen mit den NS4B-Mutanten sowie in den mit den nzp-WT-Viren infizierten Kavernen. Ein ZPE und die damit verbundene Lyse der Zellen ist ausschließlich in den mit dem CP7-WT infizierten Zellen in der Vertiefung sechs zu erkennen. Hier konnten keine zellulären Proteine mehr mit dem Farbstoff Kristallviolett gefärbt werden (Abb. 15). Damit war gezeigt, dass diese Mutation nicht nur den BVDV Stamm NADL, sondern auch andere zp Biotypen in nzp Viren wandelt. Interessanterweise zeigte sich auch zwischen CSFV Alfort/Tübingen und seiner Mutante ein Unterschied. Während die mit diesem WT infizierten Zellen in der Kristallviolettfärbung eine leicht gebrochenen Färbung zeigten, war die Kaverne mit der CSFV-NS4B-Mutante gleichmäßig angefärbt. Dies deutet darauf hin, dass CSFV Alfort/Tübingen doch eine gewisse Zellschädigung herforruft, die nach der Mutation des Tyrosins ausbleibt. Die Lebensfähigkeit und Stabilität der Mutanten im Vergleich mit den jeweiligen Wildtypen wurde über fünf Passagen verfolgt. Molekularbiologische Untersuchungen, wie die Sequenzierung der RT-PCR-Produkte, zeigten, dass nach derartiger Vermehrung der Mutanten keine Reversion über den genannten Zeitraum auftrat. Zur Abklärung, ob die jeweiligen im NS4B veränderten Viren Wachstumsnachteile gegenüber den Wildtypviren aufwiesen, wurden vergleichende Wachstumskurven ermittelt und verglichen. Hierzu wurden entsprechende Zellen mit den zu testenden Viren mit einer m.o.i von 0,01 infiziert und für verschiedene Zeiträume, von 12 bis 124 h, inkubiert. Das jeweilige Wildtypvirus diente als Kontrolle. Diese Ansätze wurden nach der entsprechenden Zeit bis zur Titration bei –72 °C gelagert. Die Untersuchung erfolgte in Triplikaten. Anhand der Wachstumskurven lässt sich erkennen, dass die Viren mit der Veränderung im NS4B gegenüber ihren WT-Vergleichsviren keine signifikanten Wachstumsvor- oder Nachteile haben. 76
ERGEBNISSE Abb. 15: NS4B-Mutanten verschiedener Pestiviren Kristallviolettfärbung von Zellen, die mit verschiedenen BVDV und CSFV infiziert worden waren. Die Färbung wurde 72 h nach der Infektion (m.o.i. = 0,1) durchgeführt. Feld 1: SK6-Zellen mit CSFV-NS4B-Mutante, Feld 4: SK6-Zellen mit CSFV-WT Feld 2: MDBK-Zellen mit NCP7-NS4B-Mutante, Feld 5: MDBK-Zellen mit NCP7-WT Feld 3: MDBK-Zellen mit CP7-NS4B-Mutante, Feld 6: MDBK-Zellen mit CP7-WT Titer KID50 (log10) 7 6 5 4 3 2 1 0 Wachstumskurven: 0 20 40 60 80 100 120 Zeit (h) CP7 NCP7 Mut-NS4B-CP7 Mut-NS4B-NCP7 Abb. 16: Wachtumskurven von CP7, NCP7 und deren NS4B-Mutanten Abgetragen sind die Titer (KID50) im Verlauf der Zeit. Die Kurven von NCP7 und CP7 fallen in vielen Punkten zusammen. 77
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Einfluss von Mutationen auf die NS2
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