Einfluss von Mutationen auf die NS2/3-Prozessierung und die ...

Spalteffizienz (%)
70,00
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
NS2/3-Spaltung bei der NS4B-Mutante
CP7-WT Mut-NS4B-CP7
Reihe1 63,51 49,83
ERGEBNISSE
Abb. 21: Vergleich der NS2/3-Spaltung des CP7-WT und der NS4B-Mutante.
Zur Ermittlung der abgetragenen Werte wurden für beide Viren drei unabhängige Experimente
durchgeführt. Die Proteine NS2/3 und NS3 wurden jeweils mit dem anti-A3-Serum präzipitiert
und die Präzipitate mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Mit Hilfe des Phosphor-Imagers wurde die
Stärke der NS2/3- und NS3-Signale ermittelt. Unter Berücksichtigung der Zahl der Methionine
und Cysteine in den jeweiligen NS2/3- bzw. NS3-Proteinen wurde der prozentuale Anteil des
NS3 an der Gesamtmenge von NS3 / NS2/3 berechnet.
3.3.6 Überprüfung der RNA-Menge
Eine seit längerem diskutierte Hypothese besagt, dass zp BVDV in infizierten
Zellen mehr RNA produzieren als die homologen nzp Viren. Weiterführende
Untersuchungen sollten diese Hypothese anhand der zuvor erwähnten
Mutanten überprüfen. Diese Analysen sollten mit Hilfe einer quantitativ-
kompetitiven RT-PCR durchgeführt werden. Dabei wird der Probe mit der
unbekannten Menge der zu bestimmenden Nukleinsäure eine definierte Menge
eines internen Standards zugegeben, der mit den gleichen Primern reagiert.
Durch Einführung einer Deletion wird die Bande des Standards vom zu
bestimmenden Produkt unterscheidbar. Durch Variation der Menge des
internen Standards bei gleichbleibender Konzentration der zu untersuchenden
Nukleinsäure ergibt sich für jeden Reaktionsansatz im Agarosegel ein
spezifisches Bandenmuster. Bei einem Überschuss eines der Reaktionspartner
verschiebt sich die Stärke der Bande zugunsten des überwiegenden
Konkurrenten. Ziel ist das Erreichen des Äquivalenzpunktes, der durch zwei
gleich stark ausgeprägte Banden im Agarosegel dargestellt wird.
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