écologie des virus influenza aviaires en Camargue - IRD

Chapitre II2.2. Biologie moléculaire et virologie.La première étape de l'analyse correspond à la détection des virus influenza dans leprélèvement. L’extraction de l’ARN viral a été réalisé à l’aide du kit QIAamp VirusBioRobot MDX (Qiagen TM ) et du BioRobot MDX (Qiagen TM ) selon les indications duconstructeur. Devant l'amélioration des techniques disponibles pour la détection des virus,plusieurs méthodes ont été employées au cours des trois saisons d'échantillonnage (i.e.années de thèse):Lors de la première saison (de septembre 2005 à juillet 2006), la présence de virusinfluenza a été détectée par transcription inverse (RT pour « reverse transcription »)et réaction de polymérisation en chaine (PCR pour « polymerase chain reaction »).L'amplification est réalisée sur environ 201 paires de bases (pb) du segment M, avecles amorces M52C: 5'­CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACG­3' et M253R: 5'­AGGGCA TTT TGG ACA AAK CGT CTA­3' (Fouchier et al. 2000). Les produitsd'amplifications sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose (1%) et colorationau bromure d'éthydium (BET). Cette méthode ayant récemment montré desproblèmes de spécificité (Busquets Marti et al. 2006), les techniques employées ontété revues afin de s'affranchir d'un tel problème, mais aussi de gagner en sensibilitédans la détection virale. L'analyse des échantillons de la seconde saison d'échantillonnage (de septembre 2006à juillet 2007) a été réalisée en couplant deux méthodes de PCR en temps réelle. Eneffet, après une phase de RT, tous les échantillons ont été analysés avec une techniquede PCR en temps réel utilisant un agent fluorescent (le SYBR Green). Karlson et al.(2007) ont récemment montré que la combinaison de cette méthode utilisant le SYBRgreen, avec une autre méthode de détection utilisant une sonde d'hybridation Taqmanpermet d'obtenir des résultats plus fiables que les méthodes d'analyses classiques(e.g. Fouchier et al. 2000). Les échantillons détectés comme positifs par la PCR entemps réel, utilisant le SYBR green, ont donc dans un second temps été confirmésavec une autre PCR en temps réel, utilisant une sonde d'hybridation: MqPCR­Probe2:5'­(fam) CCT CAA AGC CGA GAT CGC GCA (Tamra)­3'. La combinaison de cesméthodes a permis de gagner en sensibilité (SYBR Green) et spécificité (sonde36