DIPLOMOVÁ PRÁCE - Vysoká škola chemicko-technologická v Praze

laminární box - Clean air Woerden, Nizozemí
nízkotlaký chromatograf - Biologic LP, Biorad, USA
odstředivka - Beckman J2-MC, USA
odstředivka - Eppendorf 5415 C, SRN
odstředivka - Hettich EBA 12 R, SRN
orbitální inkubátor - Gallenkamp, USA
pH metr - inoLab pH Level1, WTW, SRN
předvážky – AND, Japonsko
sonikátor – Microson, UL, USA
spektrofotometr - Unicam Helios α, UK
spektrometr pro NMR - Avance DRX500, Brüker, USA
třepačka gelů - KS 125, IKA Labortechnik, SRN
vortex - IKA Labortechnik, SRN
3.2 Metody
3.2.1 Příprava kompetentních buněk
Kompetentní buňky, tedy buňky schopné přijmout plasmidovou DNA, byly připraveny
metodou dle Cohena s použitím chloridu vápenatého 78 . Buňky Escherichia coli kmene
BL21 (DE3) byly rozetřeny ze zásobní kultury na pevné LB médium a kultivovány při 37
°C přes noc. Jedna isolovaná kolonie byla použita pro přípravu 5 ml inokula. Inokulum
bylo připraveno kultivací při 37 °C v orbitálním inkubátoru při otáčkách 250 rpm přes noc.
Část inokula byla převedena do 200 ml LB media a buňky byly kultivovány při teplotě 37
°C, 250 rpm do doby, kdy optická denzita (OD), měřená při vlnové délce 590 nm, dosáhla
hodnoty 0,4. Po aseptickém převedení do předchlazených sterilních zkumavek byly buňky
odděleny od živného média centrifugací (1500 × g, 10 min, 4 °C, nízký stupeň brždění).
Všechny následující operace byly prováděny pokud možno v chladové místnosti nebo
alespoň na ledu. Peleta buněk byla resuspendována v 50 ml vychlazeného sterilního
100mM roztoku CaCl 2 . Suspenze byla ihned centrifugována (1500 × g, 10 min, 4 °C, nízký
33