DIPLOMOVÁ PRÁCE - Vysoká škola chemicko-technologická v Praze
DIPLOMOVÁ PRÁCE - Vysoká škola chemicko-technologická v Praze
DIPLOMOVÁ PRÁCE - Vysoká škola chemicko-technologická v Praze
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
3.2.9 Příprava vzorků pro NMR experimenty<br />
Určení chemických posunů vodíků na aromatických kruzích aminokyselin fenylalaninů, tryptofanů<br />
a tyrosinů ztěžuje to, že mají podobné chemické posuny jako vodíky amidických<br />
skupin. Pro určení jejich chemických posunů je proto potřeba připravit vzorek v němž jsou<br />
amidické vodíky vyměněny za deuterium. Za tímto účelem byl vzorek dvakrát lyofilizován a<br />
rozpuštěn v 99,9% těžké vodě. Mezi lyofilizacemi byl protein ponechán 3 dny při 4°C.<br />
Pro přesné měření orientace isoleucinů byl připraven vzorek, v němž byly izotopově obohaceny<br />
13 C/ 15 N pouze isoleuciny. Příprava vzorku se odlišovala pouze přídavkem 40 mg takto<br />
obohaceného isoleucinu na litr minimálního média.<br />
Pro měření residuálních dipolárních interakcí bylo nutné protein měřit v anizotropním<br />
prostředí. Tím byl stlačený 4,5% polyakrylamidový gel. Polymerační směs zpolymerovala<br />
v polymerační komůrce. Gel byl přes noc promyt v deionizované vodě a poté vysušen cca na<br />
10% původního objemu. Poté k němu bylo přidáno 250 µl vzorku proteinu a přes noc se nechal<br />
nasáknout. Poté byl gel příčně stlačen a umístěn do NMR kyvety pro měření.<br />
3.2.10 NMR spektroskopie<br />
NMR spektra byla snímána na spektrometru Avance DRX 500 firmy Bruker při 25°C. Pro<br />
měření 1 H spektra byla použita pracovní frekvence 500,132 MHz a pro 15 N spektrum 50,684<br />
MHz. Spektra byla zpracována pomocí programu NMRPipe 80 a analyzována pomocí programu<br />
Sparky 81 .<br />
Pro základní zhodnocení správného sbalení proteinu bylo u každého vzorku obohaceného 15 N<br />
měřeno 1 H- 15 N HSQC spektrum, protože změna struktury se v něm projeví posunem signálů<br />
ve spektru. Prvním krokem pro určení struktury proteinu je přiřazení chemických posunů<br />
jednotlivých atomů proteinu. Přiřazení chemických posunů 1 H, 15 N a 13 C páteře proteinu bylo<br />
provedeno na základě souboru experimentů: HNCO, HNCA, HN(CO)CA, HNCACB,<br />
CBCA(CO)NH a HB(CB)HA(CA)(CO)NH 82 . Pro přiřazení chemických posunů atomů<br />
postranních řetězců aminokyselin byla změřena spektra H(C)CH-TOCSY a (H)CCH-COSY.<br />
Vzdálenostní omezení pro výpočet struktury byla získána z editovaného ( 13 C a 15 N) 3D NO-<br />
ESY spektra. Pro přiřazení chemických posunů aromatických vodíků aminokyselin Phe, Tyr<br />
37
Change language