DIPLOMOVÁ PRÁCE - Vysoká škola chemicko-technologická v Praze

3.2.3.1 Produkce izotopově obohaceného rekombinantního matrixového
proteinu M-PMV v E. coli
Pro měření proteinu pomocí NMR spektroskopie je nutné připravit protein uniformě obohacený
o izotopy 13 C a 15 N. Tato příprava se od předešlé odlišuje pouze růstovým médiem,
ostatní podmínky zůstaly stejné. Bylo použito M9 minimální médium, ve kterém byl NH 4 Cl
nahrazen 15 NH 4 Cl a glukosa byla nahrazena uniformně 13 C obohacenou glukosou.
3.2.4 Desintegrace buněk E. coli obsahujících rekombinantní
protein
Zamražená buněčná suspenze byla pomocí horké vody rozmražena a byl k ní přidán komerční
inhibitor proteas. Poté bylo přidáno 30 mg lysozymu a směs byla inkubována za stálého
míchání 30 minut při pokojové teplotě. Následovala sonikace 3x 1,5 min při výkonu 20W na
ledu. Poté byl přidán deoxycholát do výsledné koncentrace 0,1%, směs byla poté inkubována
30 min při pokojové teplotě za stálého míchání. Poté byla přidána DNasa I do koncentrace 1
mg/ml a RNasa do koncentrace 2 mg/ml a směs byla zamíchána a inkubována při 37°C 30
min. Následovala druhá sonikace. Nerozpustné zbytky buněk byly poté odděleny centrifugací
(15 000 g, 15 min, 4°C). Pro ověření účinnosti desintegrace byla peleta resuspendována ve
fosfátovém lysovacím pufru a spolu se supernatantem nanesen na SDS PAGE.
3.2.5 Metaloafintiní chromatografie
Matrixový protein byl produkován jako fůzní polyprotein MAPPHis, přičemž PP je N-
terminální část fosfoproteinu a His je histidinová kotva. Takto bylo vytvořeno mezi MA a
histidinovou kotvou štěpné místo pro M-PMV proteasu, umožňující odštěpení samotného
MA od histidinové kotvy.
Po desintegraci buněk byly k supernatantu přidány 4 ml suspenze Ni-NTA agarosy a směs
byla inkubována za stálého míchání 1 hodinu při 4°C. Poté byla agarosa promyta 20 ml fosfátového
lysovacího pufru a 20 ml pufru pro M-PMV proteasu. Agarosa byla resuspendována
ve 4 ml proteasového pufru a 1 ml roztoku rekombinantní M-PMV proteasy (0,4
35