DIPLOMOVÁ PRÁCE - Vysoká škola chemicko-technologická v Praze

4.3.2 Výpočet struktury
Základem výpočtů struktury byla vzdálenostní omezení získaná z experimentů 15 N- a 13 C-
editované NOESY spolu s omezeními dihedrálních úhlů φ a ψ, získaných z programu TA-
LOS a vodíkovými vazbami, udržujícími oblasti α-helixů získanými z CSI. Pro základní
přiřazení NOE interakcí a výpočet počátečního souboru struktur byl použit program Aria 2.0.
V tomto programu bylo provedeno celkem 12 cyklů výpočtů, mezi kterými bylo manuálně
upravováno jak přířazení NOE interakcí, tak přiřazení resonancí, eventuálně jejich korekce.
Pro finální stádia výpočtu byl využit program NIH-XPLOR. V tomto programu bylo provedeno
31 cyklů výpočtů struktury a přiřazení dalších signálů NOE. Finální výpočet struktury
byl proveden celkem se 1442 NOE interakcemi, poskytujícími stejný počet vzdálenostních
omezení.
Aby bylo možné získat detailnější informaci o eventuálních strukturních změnách v okolí
obou mutací, byl připraven vzorek, ve kterém byly selektivně značeny uhlíkem 13 C pouze
isoleuciny. Toho jsme docílili přidáním uniformně 13 C/ 15 N-značeného L-isoleucinu do
minimálního média. Značení bylo dostatečně specifické a nedocházelo k biotransformaci
isoleucinu na jiné aminokyseliny (Obr. 16), což vedlo k značnému zjednodušení a zpřehlednění
13 C-NOESY spektra, ve kterém byly viditelné pouze NOE interakce vycházející
z isoleucinů (Obr. 17). Tímto způsobem bylo získáno dalších 89 vzdálenostních omezení.
47