dissertacia-myrzabaeva.pdf
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
Аллантоинды анықтау; 0,1 мл өсімдік үлгісі ең алдымен 100°С-та 0,1мл 0,5М<br />
NаОН және 0,2 мл бидистилденген суда 8 минутқа қайнатылады. Кейін 0°С-та<br />
4 минутта суытылады. Суытылған қоспаға келесі сатыда 0,1мл 0,65Н тұз<br />
қышқылы қосылып, қайтадан 100°С-та 4 минутқа қайнатылады.<br />
Суытылғаннан кейін 0,1 мл рН-7.0, 0,4М фосфатты буфер (Na 2 HPO 4 -KH 2 PO 4 )<br />
және 0,1 мл 18мМ фенил-гидразин қосылады. Келер сатыда қоспаға 0,5мл<br />
0°С-тағы концентрлі тұз қышқылын және реакция түсін жетілдіру үшін 0,1мл<br />
50,6мМ K-FeCy (калий феррицианидін) қосамыз. Ақырында реакциялық<br />
қоспаны 5 минутқа центрифугалап (Z 233 MK-2, HERMLE), 15минутқа бөлме<br />
температурасында инкубациялап, спектрофотометрде (JASCO, model V-530)<br />
535 нм-де оқимыз.<br />
Аллантоин қышқылын анықтау; 0,1 мл өсімдік экстрактісі 0,15Н тұз<br />
қышқылымен және 0,3 мл бидистилденген сумен 100°С-та 4 минутқа<br />
инкубацияланады. Кейін 0°С мұзға 4 минутқа салқындатылады. Келер сатыда<br />
0,1мл 0,4М фосфатты буфер (Na 2 HPO 4 -KH 2 PO 4 ) (pH-7.0) және 0,1мл 18мМ<br />
фенилгидразин қосып, кейінгі рәсімдер аллантоин әдісіндегідей жалғасады.<br />
Ксантиндегирогеназа (КДГ) ферментінің активтілігін талдау<br />
Ксантиндегидрогеназа ферментінің активтілігі нативті полиакриламидті<br />
гел электрофорезде M.Sagi және тағы басқалардың (1998ж) әдісі бойынша<br />
жүргізіледі [126, 126-бет]. Аталған галофиттердің қатынасы жапырақтар үшін<br />
1:4, тамыр үшін 1:2 болатын экстрактті буфферлі ерітіндімен: 250мМ Tris-<br />
HCl (pH 8.48), 1 мМ ЭДТА, 1мM дититрейтол (ДТТ), 5мM L-цистеин, 10мM<br />
глутатион (ГЛТ), 0.05мM Na 2 MoO 4 , 0.1мM фенил метил сульфонил флуорид<br />
және 250мM сахарозамен гомогенирленеді. Гомогенизирленген өсімдік<br />
сынамасы 14, 000 айналымда 4°С-та 20 минутқа центрифугаланады (Z233<br />
MK-2, HERMLE). Центрифугалағаннан кейін, жапырақ супернатантын 65°Ста<br />
90 секундқа қыздырып, қайта 14,000 айналымда 4°С-та 5 минутқа<br />
центрифугалаймыз. Ерігіш ақуыздардың жалпы мөлшері Брэдфорд әдісі<br />
бойынша Bio-Rad Protein Assay көмегімен және кристалды бұқа сарысу<br />
арқылы өлшенді [126, 128-бет].<br />
Нативті гел натрийдің додецилсульфатынсыз 7,5% полиакриламидпен<br />
дайындалды және 110 минутқа 4°С-қа инкубациялап, BIO-RAD (Mini<br />
PROTEAN 3 System) жиынтығының әрбір құдықшасына ақуыз мөлшері<br />
бірдей өсімдік үлгісін құямыз.<br />
Ксантин дегидрогеназа ферментін анализдеу<br />
Электрофорез әдісінен кейін КДГ активтілігі бөлме температурасында<br />
арнайы ерітінді: 50мM TРИС-HCl (pH-8.48), 3.4мM 3[4.5-диметилтиазол-2-]-<br />
2.5- дифенилтетразолиум- бромид (MTT), 0.1мM феназин метосульфат (ФМС)<br />
және 1.5мM гипоксантин және 0.5мM ксантин субстрат ретінде пайдаланып,<br />
анықталады. Реакция қараңғыда, бөлме температурасында жетілдіреді.<br />
Алынған гел нәтижелері сканерде (Microtek scanner, ScanMaker 5800) 300 dpi<br />
мөлшерінде сканерленіп, сапалық талдау үшін формазанды жолақтардың<br />
қарқындылығын анықтау үшін бағдарламалық жасақтар бойынша ImageJ<br />
талдауы жүргізіледі. Формазан мөлшері субстраттың қатысуымен және<br />
47
Change language