dissertacia-myrzabaeva.pdf

Плазмидалық ДНҚ-молекуласы ДНК рестриктазалық фермент Smа I
ферменті бойынша линеариздеп, 25мкл реакция қоспасына 10000 нг ДНК, 2.5
буфер ерітіндісі, және 2,5мкл Smа I ферментін араластырамыз.
Инкубациялағаннан кейін реакциялық қоспаны фенол ерітіндісімен
дебелогыизирледік: хлороформ (1:1), спиртпен тұнбаға түсіріп, кептіріп, 10
мкл суда ерітіп, бөліп алдық.
In- vitro транскрипция
Бір өсімдікке қажетті вирустық РНҚ-транскриптер Т-7 РНКполимеразаларды
пайдаланып, in vitro- жағдайында бөлініп алынды, олардың
құрамына: 3мкл линиарлық ДНК-молекуласы, 5xТ7 буфер, 2,5 мкл rNTР, 0,5
мкл Т-7 РНК-полимераза, 14мкл Н 2 О қосып, 37°С-та 60 минутқа
инкубациялап, кейін 80мкл буферде араластырдық.
Өсімдікті вирустық құрылымды РНҚ- транскрипттарымен
инокуляциялау
Өсімдіктерді инокуляциялау 28 күндік Nicotiana benthamiana өсімдігінің
жоғары үш жапырағын механикалық ысқылау арқылы жүзеге асты. Кейін
зақымданған өсімдіктерді UV- лампалармен бақылаймыз.
Вестерн блоттинг әдісі
Алынған мутанттардағы ақуыз экспрессиясы Вестерн-блоттинг әдісі
арқылы анықталды. Үлгілерді ұнтақтағышта ТЕ буферімен қатынасы 500 мг
жапырақ 500 мкл буферде гомогенизирлейміз. Алынған қоспаны 10.000
айналымда центрифугалап, аликвотын бөліп алып, оған крэк буферін 1:1
қосып, 2 минутқа қайнатамыз. Алынған ақуыздарды полиакриламидті гелде
110 V жүргізіп, кейін ақуыздар нитроцеллюлозды мембранаға көшіріліп,
трансферлік буферде 250мА 1,5 сағатқа электр тоғына қосылады. Кейін
алынған мембрана 7%-дық майсыз сүтте (сүт 1хТВЕ/ТWЕЕN буферінде
дайындалады) блотталып, келер сатыда қоянның бірінші реттік
антиденелерімен 90 мин гибридизациясын жүргіземіз. Алынған мембрана 10
минут 3 рет 1хТВЕ/ТWЕЕN буфермен шейкерде жуылып, екінші реттік
антиденелермен 90 минутқа (5мкл антидене 10 мл сүтке)
гибридизацияланып, ақуыз активтілігі анықталады.
49