Helmholtz-Gemeinschaft

Material & Methoden
Inaktivierung in Abhängigkeit von der Substratkonzentration:
Für die Inaktivierungsansätze wurden Substratkonzentrationen zwischen 0,05 mM und
20 mM gewählt. Ansonsten wurden die Inaktivierungsanalysen wie oben beschrieben
durchgeführt.
Inaktivierungsanalysen mit 4-ClBA in Abhängigkeit von der Enzymkonzentration:
Für die Inaktivierungsansätze wurden Enzymkonzentrationen zwischen 0,004 mg/ml BAL
und 2 mg/ml gewählt. Grundsätzlich ist der Versuchsaufbau wie oben beschrieben; die
4-Chlorbenzaldehydkonzentration betrug immer 2 mM. Für die Ermittlung der Restaktivität
relativ zur Anfangsaktivität wurde zu distinkten Zeitpunkten 200 µl einer 22 mM 4-ClBA-
Lösung zugegeben und die Reaktion nach 2 min wieder gestoppt. Aufgrund des sehr
unterschiedlichen Umsatzes bei den verschiedenen Enzymkonzentrationen mussten die
Inaktivierungsansätze aber zum Teil abweichend behandelt werden. Bei sehr geringen
Enzymkonzentrationen wurde das Probenvolumen zur Ermittlung der Aktivität vergrößert, bei
höheren Enzymkonzentrationen mussten die Proben vor Ermittlung der relativen Aktivität
verdünnt werden. Wie die entsprechenden Proben abhängig von der Enzymkonzentration für
die Ermittlung der relativen Aktivität eingesetzt wurden, ist in Tabelle 8 zusammengefasst.
Tabelle 8: Probenvolumina und Verdünnung der Inaktivierungsansätze
Enzymkonz.
[mg/ml]
Inaktivierungsansatz
[µl]
0,004 200 -
0,008 100 -
0,04 25 -
0,08 12,5 -
0,2 50 1:10
0,5 50 1:25
2 50 1:100
Verdünnung in Reaktionspuffer
pH 8
3.10.4 Ermittlung der Desaktivierungskonstanten k des und der Halbwertszeit
Durch die Enzyminaktivierung, nimmt die Konzentration an aktivem Enzym (E)
kontinuierlich ab, durch die Desaktivierungskonstante k des kann die Rate der Inaktivierung
beschrieben werden:
dE
= −k
des
⋅ E
Gleichung 4
dt
Die Enzyminaktivierung kann durch Integration der Gleichung, als exponentielle Abnahme
der Aktivität erster Ordnung in Abhängigkeit von der Zeit beschrieben werden:
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