Helmholtz-Gemeinschaft

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Fazit: Es hat also den Anschein, dass die Stabilisierung der BAL durch DMSO als
Kosolvents, zumindest zum Teil durch eine Beeinflussung des flexiblen C-Terminus erreicht
wird. Der C-Terminus ist also nicht unbedingt nur an der katalytischen Aktivität der BAL
entscheidend beteiligt, sondern vermutlich auch an der Stabilität der BAL.
4.3.3.2 Einfluss des C-Terminus auf die Stabilität der BAL gegenüber aromatischen
Aldehyden
Da die sich BAL Deletionsvarianten hinsichtlich der Kinetik der Ligasereaktion (fehlende
Substratsättigung) ähnlich wie die BFDH281A verhalten (Kocot, 2010), sollte nun auch ihre
Stabilität gegenüber aromatischen Aldehyden überprüft werden. Hierbei wurde entsprechend
den Versuchen mit der Wildtyp BAL verfahren (Kapitel 3.10.3). Erste Versuche von Kocot
zeigten tatsächlich eine signifikante Stabilisierung der HisBALΔ gegenüber Benzaldehyd
(Kocot, 2010). Mit einer k des von 0,47% min -1 zeigt die Variante eine etwa 5-fach erhöhte
Stabilität gegenüber Benzaldehyd im Vergleich zur Wildtyp BAL (k des : 2,5 ± 0,8 % min -1 ;
diese Arbeit). Auch bei Inkubation mit einer wesentlich höheren Benzaldehydkonzentration
(15 mM) konnte keine signifikant erhöhte Inaktivierung beobachtet werden (k des :
0,51% min -1 ) (Kocot, 2010).
Aufgrund der von Kocot ermittelten Stabilisierung der HisBALΔ Variante gegenüber
Benzaldehyd, sollte auch ihre Sensitivität gegenüber 3,5-Dimethoxybenzaldehyd und
4-Chlorbenzaldehyd überprüft werden. Außerdem wurde die Variante BALΔHis überprüft,
um auszuschließen, dass die beobachtete Stabilisierung in der Verlegung des His-Tags zum
N-Terminus begründet ist. Theoretisch wäre auch eine Schiffbasenbildung der Aldehyde mit
der α-Aminogruppe des oberflächenlokalisiertem N-terminalen Methionins denkbar.
Ein Vergleich der ermittelten Desaktivierungskonstanten zeigt, dass beide Deletionsvarianten
eine signifikante Stabilisierung gegenüber Benzaldehyd (HisBALΔ k des : 0,5% min -1 ;
BALΔHis k des : 0,4% min -1 ) und 3,5-Dimethoxybenzaldehyd aufweisen (HisBALΔ k des : 0,2%
min -1 ; BALΔHis k des : 0,2% min -1 ). Dies entspricht einer Stabilisierung um das 5-10 Fache
gegenüber der Wildtyp BAL. Gegenüber 4-Chlorbenzaldehyd zeigen beide Deletionsvarianten
keine nennenswerte Stabilisierung (HisBALΔ k des : 2,1% min -1 ; BALΔHis k des :
2,7% min -1 ) im Vergleich zum Wildtyp. Ein Vergleich der beiden Varianten ergab keine
Unterschiede (Abb. 78). Die Stabilisierung der HisBALΔ gegenüber Benzaldehyd ist also
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