Helmholtz-Gemeinschaft

Ergebnisse & Diskussion
Als Ursache der erschwerten Produktfreisetzung wird eine α-Helix im C-terminalen Bereich
der BAL diskutiert, welche zu einer Verengung des Substratkanals führen kann. Dies setzt
allerdings voraus, dass die Struktur dieses Bereichs in Lösung der im Kristall entspricht. Da
die BFDH281A im Vergleich zur BAL um 35 Aminosäurereste verkürzt ist, fehlt dieser
Bereich in der BFD (Abb. 75 und Kapitel 1.4.4.3). In ihrer Arbeit entwickelte Kocot BAL
Varianten mit verkürztem C-Terminus, die somit der BFDH281A strukturell noch ähnlicher
waren (Kocot, 2010).
Wie in Abb. 76 schematisch dargestellt, wurde bei der HisBALΔ Variante die C-terminale
α-Helix sowie der C-terminal fusionierte Hexahistidin Tag (His 6 ) (in der Kristallstruktur nicht
erkennbar) entfernt. Dafür wurde für die Reinigung über Ni 2+ -NTA Agarose ein N-terminaler
His-Tag eingefügt. So sollte eine Blockierung des Substratkanals vermieden und der Einfluss
des gesamten C-Terminus auf die Aktivität sowie Stabilität untersucht werden. Zusätzlich
wurde zwischen dem His-Tag und der BAL-kodierenden Sequenz, die Erkennungssequenz
für die FaktorXa-Protease eingefügt, so kann der His-Tag nach Reinigung des Enzyms
entfernt werden, wenn gewünscht.
Original
BAL Helix C-Terminus His 6
(1-550) (551-555) (556-563)
HisBALΔ
His 6
Xa
BAL
BALΔHis
BAL His 6
Abb. 76: Schematische Darstellung der verwendeten BAL-Sequenz sowie der Deletionsvarianten (nach
Kocot, 2010). In diesem Schema wurde die original BAL-Sequenz in vier strukturell wichtige Einheiten unterteilt;
BAL: N-terminaler Bereich (1 - 550 AS), Helix: die zu deletierende α-Helix (Δ 551 – 555 AS), C-Terminus:
flexibler C-Terminus; zu deletierender Bereich (Δ 556 - 563 AS), His 6 : Hexahistidin-Sequenz. Bei der Variante
HisBAL∆ wurde die komplette C-Terminus kodierende Sequenz entfernt und der His-Tag an den N-Terminus
verschoben. Zusätzlich wurde eine Faktor Xa-Protease Erkennungssequenz (Xa) zwischen His-Tag und BAL-
Sequenz eingefügt. Bei der Variante BAL∆His wurde nur die α-Helix und der C-Terminus kodierende
Sequenzbereich der BAL deletiert.
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