Helmholtz-Gemeinschaft

Material & Methoden
2-fachen Volumen Entsalzungspuffer äquilibriert, die Probe aufgetragen und mit Entsalzungspuffer
bis zur Elution des Proteins gespült. Geringe Probenmengen (bis 20 ml) wurden
alternativ über PD-10 Säulen (GE Healthcare, München, Deutschland) nach Herstellerangaben
unter Verwendung des Entsalzungspuffers entsalzt.
3.6.3 Lagerung gereinigter Proteine
Die in dieser Arbeit verwendeten Enzyme wurden in gefriergetrockneter Form bei -20 °C
gelagert. Für eine Gefriertrocknung (Lyophilisation) wurden die gereinigten und entsalzten
Proteinfraktionen (Kapitel. 3.6.2) in einer flachen Glasschale mit maximal 1,5 cm Füllhöhe
und maximal 1–1,5 mg/ml Proteinkonzentration bei -20 °C eingefroren. Die gefrorene Lösung
wurde in einer Lyophille (Lyovac GT2 oder Alpha 2-4) gefriergetrocknet.
3.7 Synthese von Benzoin-Derivaten
Für die Ermittlung der spezifischen Ligase- und Lyaseaktivität (Kapitel 3.9.2.1 und 3.9.2.3)
mussten die kommerziell nicht verfügbaren Benzoin-Derivate zuerst synthetisiert werden. Für
die Synthese der Benzoin-Derivate wurde die BAL verwendet.
3.7.1 Synthese von 3,3´,5,5´-Tetramethoxybenzoin
Reaktionspuffer pH 8: Substratlösung (1 M):
50 mM Kpi 166,2 mg/ml 3,5-Dimethoxybenzaldehyd in MTBE
0,5 mM MgSO 4
0,1 mM ThDP Enzymlösung:
30 % MTBE (v/v) 1 mg/ml BAL in Reaktionspuffer
Die Synthese von 3,3´,5,5´-Tetramethoxybenzoin (TMBZ) wurde noch in Kpi-Puffer
durchgeführt. Hier ergaben sich besonders bei Zugabe von DMSO Probleme durch
Präzipitation von Magnesiumphosphat im schwach alkalischen Bereich (Kapitel 4.1.5).
Deshalb wurde als zweites Lösungsmittel MTBE eingesetzt. Da MTBE aber nur zu etwa
5 vol% in Puffer löslich ist wurde ein 2-Phasen Reaktionsansatz gewählt um eine ausreichend
hohe Konzentration des Substrats 3,5-Dimethoxybenzaldehyd (DMBA) einsetzen zu können.
Zu 18,5 ml Reaktionspuffer wurden 5,5 ml MTBE, 120 µl Enzymlösung und 1 ml Substratlösung
gegeben und über Nacht gerührt (600 Upm, 25 °C). Anschließend wurde die MTBE-
Phase, welche den Großteil der aromatischen Aldehyde und Benzoine enthält, unter Vakuum
eingeengt und auf eine präparative Dünnschichtchromatographieplatte (DC) aufgetragen.
51