Helmholtz-Gemeinschaft

Material & Methoden
3.9.1.2 Gekoppelter photometrischer Test zur Bestimmung der Lyaseaktivität
(BAL)
Reaktionspuffer pH 8:
Benzoin-Stammlösung:
50 mM Kpi 31,8 mg Benzoin in PEG 400
2,5 mM MgSO 4
0,1 mM ThDP
NADH-Lösung
Benzoin-Lösung 1,76 mM:
3,5-7 mM NADH in Reaktionspuffer 1,5 ml Benzoin-Stammlösung
7 ml Reaktionspuffer
HL-ADH-Lösung:
2,5-5 U/ml HL-ADH in Reaktionspuffer
Die Lyaseaktivität der BAL wurde unter anderem in einem gekoppelten photometrischen Test
bestimmt. In diesem Test wird die Spaltung von einem Benzoin-Molekül zu zwei
Benzaldehyd-Molekülen, welche die Alkoholdehydrogenase aus der Pferdeleber (HL-ADH)
unter NADH-Verbrauch zu Benzalkohol reduziert, nachgewiesen. Die Messung der Aktivität
erfolgte über die Messung der NADH-Abnahme bei 340 nm (Abb. 18).
BAL
2 HL-ADH 2
Benzoin
Benzaldehyd
NADH NAD +
Benzalkohol
Abb. 18: Gekoppelter Benzoin-Lyase Test. 1 Benzoin-Molekül wird zu zwei Benzaldehyd-Molekülen durch
die BAL gespalten. Der entstandene Benzaldehyd wird wiederum durch die HL-ADH unter NADH-Verbrauch
zu Benzalkohol reduziert.
Zu 800 µl Benzoin-Lösung werden 100 µl NADH- und 50 µl HL-ADH Lösung direkt in eine
1,5 ml Kunstoff-Küvette gegeben und mit einem Spatel gemischt. In der Benzoin-Lösung war
stets ein geringer Anteil Benzaldehyd enthalten, welcher durch autokatalytischen Zerfall des
Benzoins entstanden ist. Dieser wurde sofort nach Zugabe der HL-ADH reduziert und hatte
bereits einen hohen NADH-Verbrauch zur Folge. Der Ansatz wurde für 5-10 min bei 30 °C
im Spektrophotometer inkubiert um eine möglichst vollständige Reduktion des Benzaldehyds
zu gewährleisten. Die NADH-Konzentration wurde so hoch gewählt, dass nach dieser Zeit die
Absorption bei 340 nm noch 2-2,2 betrug. Durch Zugabe von 50 µl BAL-Lösung wurde die
Zielreaktion gestartet und alle 10 Sek die Absorption über einen Messzeitraum von 90 Sek
verfolgt. Die volumetrische und spezifische Aktivität wurde wie in Kapitel 3.9.1.1
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