Helmholtz-Gemeinschaft

Ergebnisse & Diskussion
Abstoßungseffekte zwischen Protein und Adsorptionsoberfläche führt. Für die BAL wurde
ein pI von 4,6 mittels isoelektrischer Fokussierung ermittelt (Janzen et al., 2006), während der
pI für die BFD bei pH 6,5 liegt (Hasson et al., 1995). Da bei der Variante BFDH281A nur
eine Aminosäure ausgetauscht wurde ist keine nennenswerte Änderung im pI zu erwarten.
Aufgrund der höheren Nettoladung der BAL bei pH 6,5 gegenüber der BFDH281A ist also
eine geringere Adsorption an die Teflonoberfläche sehr wahrscheinlich. Die ungleiche
Adsorptionsrate wiederum könnte zu den unterschiedlich ausgeprägten Inaktivierungseffekten
führen. Bei pH 6,5 ist bei der BAL eine höhere Inaktivierung in der Probe mit dem kleineren
Volumen (0,6 ml) zu beobachten als bei den anderen Proben. Dies könnte auf die erhöhte
Zugänglichkeit des Enzyms für die Rührfischoberfläche zurückzuführen sein, so wirkt sich
der destabilisierende Effekt verstärkt aus.
Eine SDS-PAGE-Analyse der BFDH281A weist auf einen weiteren Effekt durch den
magnetischen Rührprozess hin. Eine 24 Stunden gerührte und vollständig inaktivierte
Enzymprobe wurde vergleichend zu einer nicht gerührten Kontrolle elektrophoretisch
aufgetrennt.
Abb. 53: Vergleichende SDS-PAGE Analyse der nativen BFDH281A (K) und einer vollständig
inaktivierten Probe (P). Links: schematische Darstellung der intermolekularen kovalenten Verknüpfung von
zwei Monomeren mittels Oxidation und die Spaltung der Disulfidbrücken durch ein Reduktionsmittel. Rechts:
ca. 30-35 μg gereinigtes Enzym wurden nach 24 h Inkubation auf dem Magnetrührer gelelektrophoretisch auf
einem 12%igen SDS-Gel aufgetrennt und mit Coomassie Brilliant-Blau gefärbt. K: ungerührte Kontrolle; P:
gerührte Probe; Magnetrührer 1400 Upm; 1 mg/ml BFDH281A in 50 mM Kpi-Puffer, pH 6,5; 0,1 mM ThDP;
2,5 mM MgSO 4 . -Mercaptoethanol (Inkubation ca. 7 min bei 98 °C), M: Marker (Page
Ruler TM Unstained Protein Ladder, Fermentas).
Durch den denaturierenden Charakter von SDS werden Proteinaggregate, die nicht kovalent
miteinander verknüpft sind, wieder voneinander getrennt, so dass einzelne Proteinketten nach
Coomassie-Färbung als eine distinkte Bande zu erkennen sind. Die Oxidation von Proteinen
kann über Cysteinreste zu intra- und intermolekulaten Disulfidbrücken führen. Diese
- 99 -