Helmholtz-Gemeinschaft

Ergebnisse & Diskussion
Aldehyde darstellt und eine Reaktion an dieser Position zur Inaktivierung der BAL beitragen
kann.
Abb. 73: Zur Modifikation verwendete Anhydride und mPEG-Derivate (van den Wittenboer, 2009) mit
Benzaldehyd im Vergleich.
Ob die beobachtetet Inaktivierung der BAL durch eine Schiffbasenbildung am Lys127
hervorgerufen werden könnte, sollte durch den Austausch zu anderen Aminosäuren, mittels
gezielter Mutagenese überprüft werden.
4.3.2.2 BAL-Varianten zur Überprüfung der Schiffbasen-Hypothese
Anhand der 3D-Struktur wurden mögliche Aminosäuren identifiziert, gegen welche das
Lys127, unter Berücksichtigung von sterischen Aspekten, polaren Wechselwirkungen usw.,
ausgetauscht werden kann. Wenn eine Schiffbasenbildung am Lys127 mit den Aldehyden
tatsächlich zu einer Inaktivierung der BAL führt, könnte auch ein Aminosäureaustausch an
dieser Stelle inaktivierend wirken. Aus diesem Grund wurden acht Varianten geplant. Und
zwar sollte Lys127 gegen die Aminosäuren Alanin, Arginin, Asparagin, Glutamat, Glutamin,
Isoleucin, Leucin und Methionin getauscht werden. Die gewünschten Mutationen wurden bei
Sloning Biotechnologie mit Sitz in München in Auftrag und wie in Kapitel 3.3.6 beschrieben
behandelt. Die Varianten wurden zunächst in kleinen Maßstab (10 ml) überexprimiert
(Kapitel 3.4.5 und 3.3.3). Nach Zellaufschluss wurde mittels eines kolorimetrischen Tests
(Kapitel 3.9.4) oder des Fluoreszenz basierten Tests (Kapitel 3.9.1.3.2) eine Ligaseaktivität
der Varianten im Rohextrakt nachgewiesen. Für alle Varianten konnte eine Ligaseaktivität
bestätigt werden.
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